人类胎儿胰腺干细胞的长期体外扩增及其向三种胰腺细胞谱系的分化

胰腺是一个复杂的器官，具有外分泌和内分泌两种功能。成熟的胰腺主要由三种上皮细胞类型组成：分泌消化酶的腺泡细胞、形成导管系统的导管细胞，以及分泌激素的内分泌细胞(如胰岛β细胞)。在胚胎发育过程中，这三种细胞类型被认为起源于一个共同的多能祖细胞。小鼠研究表明，胰腺的三个主要细胞谱系确实来源于一个短暂存在的共同胰腺祖细胞。然而，对于人类胰腺发育的研究主要局限于形态学方法，缺乏功能性的体外模型系统。近年来，虽然基于人类多能干细胞(hPSCs)的分化方案取得了进展，特别是在生成胰岛β细胞方面，但这些方法通常只能产生单一细胞类型，且存在扩增能力有限、难以长期培养等问题。

类器官技术为器官发育和维持的体外建模提供了新的可能性。然而，现有的胰腺类器官模型存在明显局限性：成体胰腺类器官主要局限于导管细胞谱系，缺乏腺泡细胞和内分泌细胞;而基于胎儿组织的类器官建立成功率低，且难以长期培养。更重要的是，人类三潜能胰腺干/祖细胞的存在及其特征标志物仍有待确定。因此，建立一个能够忠实反映人类胰腺上皮复杂性、可长期扩增并具有多向分化潜能的体外模型系统，对于理解人类胰腺发育、生理和病理过程具有重要意义。

近期，发表在Cell期刊上一篇题为Long-term in vitro expansion of a human fetal pancreas stem cell that generates all three pancreatic cell lineages的研究论文成功建立了可长期扩增的人胎儿胰腺类器官系统，并鉴定出LGR5作为人类三潜能胰腺干细胞的特异性标志物。

图示描述

1，人类胎儿胰腺类器官的成功建立与长期培养。研究团队从妊娠8-17周的人胎儿胰腺组织中成功建立了18个类器官系(hfPOs)。通过对40种不同培养基组合的系统性测试，研究人员优化了培养条件，发现只有特定的hfPO培养基能够支持具有特征性"葡萄串"样出芽形态的类器官生长。这些出芽型类器官主要来源于14-16周妊娠期的胎儿组织，而囊性类器官则可以从更广泛的妊娠期组织中获得。值得注意的是，出芽型类器官能够在体外稳定扩增超过2年，其中最长的培养时间达到3年，显示出卓越的长期培养能力。冷冻保存2.5年后的类器官仍能恢复正常的增殖速度，证明了其稳定性和实用性。

图1 类器官的构建

2，出芽型类器官表达腺泡祖细胞标志物并具有分化潜能。通过大规模RNA测序分析，研究发现出芽型和囊性hfPOs具有不同的转录组特征。出芽型hfPOs高表达腺泡细胞标志物(如CPA1、RBPJL、PTF1A)，而囊性hfPOs主要表达导管细胞标志物(如KRT7、MUC1、CEACAM6)。更重要的是，只有出芽型hfPOs表达内分泌标志物(如NEUROG3、CHGA、CHGB)。为了验证分化潜能，研究人员利用CRISPR技术构建了CPA1和PTF1A荧光报告细胞系。在腺泡分化培养基(hfPO-AC)中培养7天后，CPA1+和PTF1A+细胞的数量显著增加，同时上调了多种消化酶的表达，包括胰蛋白酶、RNase、脂肪酶等。透射电镜观察显示分化后的细胞具有典型的酶原颗粒结构，进一步证实了向腺泡细胞的成功分化。

图 2 出芽型类器官与囊性类器官不同

3，内分泌细胞的产生与功能验证。研究团队构建了CHGA荧光报告系统来追踪内分泌细胞的产生。在内分泌分化培养基(hfPO-EC)中，CHGA+细胞的数量增加了5-10倍。RNA测序结果显示，分化后的类器官上调了胰腺激素基因的表达，包括胰岛素(INS)、胰高血糖素(GCG)、生长抑素(SST)、胃泌素(GHRL)和胰多肽(PPY)。免疫荧光染色证实了多激素阳性细胞和单激素阳性细胞的存在，这与胎儿胰腺发育过程中内分泌细胞的成熟模式一致。功能分析显示，分化后的类器官能够分泌C肽，证明具有胰岛素产生能力。重要的是，即使在体外培养2年后，hfPOs仍保持产生内分泌细胞的能力，显示了其长期稳定性。

4，类器官重现人胎儿胰腺的细胞异质性。通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术，研究人员将hfPOs与已发表的人胎儿胰腺组织数据进行了深入比较。分析结果显示，hfPOs在转录组水平上与相应发育阶段的胎儿胰腺组织高度相似，特别是在细胞类型组成和基因表达模式方面。hfPOs中各细胞谱系的比例更接近胎儿胰腺组织，而非成体胰腺组织。进一步的比较分析显示，hfPOs产生的腺泡细胞、导管细胞和内分泌细胞在分子特征上都与胎儿胰腺组织中的相应细胞类型高度匹配，证明了类器官系统的生物学相关性和准确性。

图 3 类器官向腺泡谱系的分化

5，LGR5标记三潜能胰腺干细胞的发现。通过深入的生物信息学分析和RNA速度场分析，研究人员发现LGR5+细胞位于分化层次的顶端，是所有三种胰腺细胞谱系的共同祖先。LGR5+细胞还共表达TROY、ZNRF3等肠道干细胞标志物，显示了不同器官干细胞间的共同特征。单细胞分离实验证明，LGR5+细胞具有显著更高的类器官形成能力(21%)，远超过LGR5-细胞(2.2%)。更重要的是，来源于单个LGR5+细胞的克隆性类器官能够产生表达腺泡(CPA1+)、导管(KRT19+)和内分泌(CHGA+)标志物的细胞，直接证明了其三潜能特性。体内移植实验进一步验证了LGR5+细胞的多向分化能力，移植后的类器官在小鼠体内形成包含三种细胞类型的组织结构。

图 4 类器官可向内分泌谱系分化

全文总结

该项研究填补了人类胰腺发育研究的重要空白，为理解胰腺器官发生、细胞命运决定和再生机制提供了强有力的工具。建立的类器官平台不仅可用于基础研究，还为胰腺疾病(如糖尿病、胰腺癌)的建模和治疗策略开发提供了新的可能性。特别是LGR5+三潜能干细胞的发现，为开发基于干细胞的胰腺再生疗法奠定了理论基础，可能为胰腺功能障碍患者提供新的治疗选择。