眼部ad MSCs追踪新方案IVIS+Alu PCR联手，7 天摸清细胞去向为眼疗安全保驾护航

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具。

基本信息

英文标题：Tracking adipose-derived mesenchymal stromal cells in the eye: Integrating IVIS imaging and Alu PCR for enhanced detection of human cells

中文标题：眼部脂肪来源间充质基质细胞示踪：整合 IVIS 成像与 Alu PCR 提升人细胞检测效率

发表期刊：《Regenerative Therapy》

影响因子：3.5

作者单位：

1. Department of Clinical Regenerative Medicine, Fujita Health University, Tokyo, Japan

2. Department of Physiology, Keio University School of Medicine, Tokyo, Japan

3. Department of Orthopedic Surgery, Keio University School of Medicine, Tokyo, Japan

作者信息：

Robert M. Rusch, Emi Inagaki, Kentaro Ago

研究背景

细胞移植在干细胞治疗、癌症研究等医学领域应用广泛，但存在肿瘤形成、免疫排斥等固有风险，亟需明确移植细胞的动态变化(如分布、迁移、存活)以评估疗效与安全性，传统成像方法(如 Z-stack、叠加成像)受限于样本大小、细胞定位判断困难且无法实现动态监测，而生物发光成像(BLI)结合在体成像系统(IVIS)具备非侵入、实时追踪优势，可通过基因修饰使细胞表达荧光素酶(如萤火虫荧光素酶 FFLuc)长期监测细胞存活与增殖;脂肪来源间充质基质细胞(adMSCs)因易获取、伦理争议少、致瘤性低，在眼部疾病(如角膜衰竭、眼表炎症)治疗中潜力显著，但此前缺乏对其结膜下注射后生物分布与迁移的追踪研究，本研究通过慢病毒载体将 FFLuc 基因导入 adMSCs，结合 IVIS 成像与 Alu PCR(检测人 DNA)，建立 “体外验证 - 体内追踪” 的完整方法，探究 adMSCs 在眼部的短期动态，为眼部细胞治疗的安全性与有效性评估提供技术支撑。

研究方法

慢病毒载体构建与扩增

以 HEK293T 细胞为宿主，将包装质粒(pCAG-HIVgp)、VSV-G/Rev 质粒(pCMV-VSV-G-RSV-Rev)与含 CAG 启动子 - 萤火虫荧光素酶(CAG-ffLuc-cp156)的 SIN 载体质粒共转染，经 PEI 介导转染、forskolin 诱导培养 48 小时后，通过 0.45μm 滤膜过滤、超速离心富集病毒，最终获得滴度为 1×10⁸-1×10¹⁰ IU/mL 的慢病毒载体，该载体可使细胞同时表达 FFLuc 与 GFP(用于后续分选)、。

adMSC 的转染、分选与扩增

复苏 ROHTO 制药提供的人 adMSCs(1×10⁶细胞 / 管)，用含 10% FBS、1% 青霉素 / 链霉素的 DMEM/Ham's F12 培养基培养;待细胞汇合后，以 1×10⁹ IU/mL 的 CAG-ffLuc-cp156 载体转染，48 小时后通过 MoFlo XDP 流式细胞仪分选 GFP⁺细胞;分选后的细胞在含 10% FBS 的 DMEM 中培养 2-3 周(1-2 代)，直至达到实验所需数量、。

Alu PCR 与体外稀释曲线实验

Alu PCR 用于检测小鼠组织中的人 DNA，参照专利(JP2017192365A)流程，提取眼、眼附属器、肝、脾、肺组织(20-120mg / 份)的 DNA，使用 Alu-Yd6 引物、Universal Probe Library Probe #51，通过 LightCycler®480 Probe Master 试剂盒与 QuantStudio 3 仪器进行 PCR;体外稀释曲线实验中，将 1×10⁵转染 adMSCs 按 10 倍梯度稀释至 1×10¹ 细胞，加入荧光素后用 IVIS Spectrum 系统检测发光信号，确定 IVIS 的检测限、。

体内实验与 IVIS 成像

采用 8 周龄雌性 Balb/cCrSlc 小鼠，分为结膜下注射 Day 0 组、Day 7 组与尾静脉注射阳性对照组;将 2×10⁵转染 adMSCs(30μL 体积)通过 29G 注射器结膜下注射，以混合麻醉剂(Domitor、Midazolam、Vetorphale)麻醉小鼠，眼部辅以 0.4% 奥布卡因表面麻醉;IVIS 成像时，小鼠腹腔注射 500μL VivoGlo™荧光素，5 分钟后检测，参数设置为：体内曝光时间 60s、binning=8、视野 23cm、f/stop=1，用 Living Image 4.5.5 软件分析 ROI(注射部位)的辐射强度(光子 / 秒 /cm²/ 球面度)。

实验结果

图1：IVIS 检测限与转染效率验证

A-B 图 显示转染流程(转染→分选→扩增)及 GFP 通道下的转染效率，证实 CAG-ffLuc-cp156 可有效介导 adMSCs 表达 GFP;C-D 图 为体外稀释曲线结果：1×10⁵-1×10³ 细胞的发光信号与细胞数量呈线性相关，2×10³ 细胞后线性关系显著下降，2×10² 细胞偏离标准曲线，1×10¹ 细胞与背景噪音无法区分，确定 IVIS 对 adMSCs 的可靠检测限为 2×10³ 细胞。

图2：adMSCs 结膜下注射后的 IVIS 动态追踪

A 图 为实验流程(转染→结膜下注射→IVIS 成像);B 图 显示注射后眼部出现短暂肿胀(数小时内消退);C-E 图 显示辐射强度随时间变化：Day 0 时信号最强，随后呈指数下降，Day 2-3 信号显著减弱，Day 7 时与背景噪音无法区分;全身成像显示，所有时间点均未在注射部位外(如肝、脾、肺)检测到 adMSCs 信号，证实 adMSCs 未发生远处迁移。

图3：Alu PCR 检测人 DNA 分布

尾静脉注射阳性对照组中，仅肺组织检测到人 DNA;结膜下注射 Day 0 时，眼附属器组织人 DNA 阳性率最高，眼部组织也有少量检出;Day 7 时，眼、眼附属器、肝、脾、肺组织均未检测到人 DNA，与 IVIS 结果一致，证实 adMSCs 在 7 天内从宿主体内清除，无长期滞留。

研究结论

本研究建立的 “IVIS 成像 + Alu PCR” 联合方法，可高效追踪眼部 adMSCs 的短期动态，其中 IVIS 实现非侵入实时监测，Alu PCR 通过人 DNA 检测验证细胞清除，二者互补提升结果可靠性，为眼部细胞治疗的示踪提供标准化技术路径;结膜下注射的 adMSCs 在 7 天内完全清除，无远处器官迁移，且未检测到长期滞留，结合 adMSCs 本身低致瘤性的特点，证实其在眼部应用的短期安全性，为角膜衰竭、眼表炎症等疾病的细胞治疗提供安全依据;但研究存在局限，IVIS 检测限(2×10³ 细胞)可能遗漏少量残留细胞，未来可采用更灵敏的 Akaluc 报告基因，且本研究仅评估 7 天内动态，需进一步探索长期疗效与细胞命运，不同注射剂量对信号稳定性的影响也需后续优化，以完善临床应用方案。