HBV 入侵关键互作找到！不扰胆汁酸，新药新靶点

乙肝病毒(HBV)感染是全球主要公共卫生问题之一，有超过2.5亿人慢性感染HBV。而其中有超三分之一的人口集中在我国，人数接近1亿人。NTCP工具细胞，特别是外源表达NTCP的肝癌细胞系如HepG2-NTCP和Huh7-NTCP，因其易操作、短周期、重现性佳的特点，在乙肝病毒(HBV)研究中扮演着至关重要的角色。这些细胞模型能够有效模拟HBV的感染过程，为研究HBV的生命周期、宿主限制因子、病毒复制以及药物筛选提供了一个强大而便捷的体外平台。它们不仅有助于揭示HBV感染的分子机制，如DDX3作为宿主限制因子阻碍cccDNA转录，GPC5作为附着因子在感染入胞过程中的作用，还能通过直接与NTCP相互作用或下调NTCP表达来筛选和验证抗病毒药物的活性，例如环孢菌素A及其衍生物、雷帕霉素及其衍生物等。此外，这些工具细胞还促进了对HBV宿主特异性分子的发现，为发展支持HBV感染的小动物模型提供了可能，这对于乙肝相关研究和药物开发具有重大意义。

基本信息

英文标题：Interaction between W41 of the hepatitis B virus preS1 surface peptide and Y146/F274 of the cellular receptor molecule (Na^{+}/) taurocholate co-transporting polypeptide is essential for virus entry

中文标题：乙型肝炎病毒preS1表面肽的W41与细胞受体钠/牛磺胆酸共转运多肽的Y146/F274之间的相互作用对病毒进入至关重要

发表期刊：《Molecular Pharmacology 》

影响因子：3.0

作者单位：

1. Institute of Pharmacology and Toxicology, Faculty of Veterinary Medicine, Biomedical Research Center Seltersberg, Justus Liebig University of Giessen, Giessen, Germany

2. Institute of Medical Virology, National Reference Center for Hepatitis B Viruses and Hepatitis D Viruses, German Center for Infection Research (DZIF, Partner Site Giessen-Marburg-Langen), Faculty of Medicine, Justus Liebig University Giessen, Giessen, Germany

3. Institute of Veterinary Physiology and Biochemistry, Faculty of Veterinary Medicine, Justus Liebig University of Giessen, Giessen, Germany

作者信息：

Sebastian Kunz¹^, Lena Soppa²^, Regina Leidolf¹, Anita Neubauer¹, Thomas Lütteke³, Dieter Glebe², Joachim Geyer¹*

研究背景

乙型肝炎病毒(HBV)依赖大表面蛋白的豆蔻酰化preS1结构域(myr-preS1)与肝细胞表面受体钠/牛磺胆酸共转运多肽(NTCP)结合实现入侵，NTCP同时承担肝脏胆汁酸转运的生理功能。现有HBV/HDV进入抑制剂(如bulevirtide)多非选择性抑制NTCP，导致血浆胆汁酸升高，长期安全性不明;虽冷冻电镜已解析myr-preS1-NTCP复合物结构，但需明确不干扰胆汁酸转运的病毒特异性结合位点。本研究基于复合物结构(PDB 8RQF)，聚焦myr-preS1的色氨酸41(W41)与NTCP的酪氨酸146(Y146)、苯丙氨酸274(F274)的相互作用——该位点远离NTCP的胆汁酸结合通道，通过分子动力学模拟、突变体功能验证及体外感染实验，明确其对HBV进入的必要性，为开发选择性抑制剂提供靶点。

研究方法

基于myr-preS1类似物bulevirtide与NTCP的冷冻电镜结构(PDB 8RQF)，用YASARA软件进行分子动力学(MD)模拟：将复合物嵌入人工磷脂膜，在生理条件(37℃、pH7.4、0.15M NaCl)下运行20组独立模拟(每组100ps)，分析结合能及π-π/疏水相互作用;通过定点突变构建NTCP Y146A/F274A双突变体，转染T-Rex Flp-In HEK293细胞建立稳定株，用免疫荧光(抗FLAG抗体)和Western blot(膜蛋白提取后PNGase F去糖基化)验证NTCP定位与表达;功能实验中，用荧光标记胆汁酸3α-NBD-TCA和放射性[³H]TCA检测胆汁酸转运能力，用Alexa 568标记myr-preS1(myr-preS1-AX568)和放射性[³H]preS1检测preS1结合能力;构建preS1 W41G突变体，通过竞争性结合实验计算IC50;体外感染实验中，将NTCP野生型/双突变体转染HepG2细胞，感染HBV基因型D3毒株，检测上清HBeAg水平评估感染效率，所有统计用GraphPad Prism进行t检验或ANOVA(p<0.05为显著)。

实验结果

图1：基于bulevirtide-NTCP冷冻电镜结构的myr-preS1与NTCP分子相互作用位点

A图 展示NTCP的9个跨膜结构域(TM)及与bulevirtide(myr-preS1类似物)的结合区域，bulevirtide分为plug结构(2-20aa，橙色)和string结构(21-48aa，蓝色)，二者分别与NTCP的TM1、5、8b、9及胞外环(EL)2、4相互作用;

B图 呈现氨基酸水平的分子互作，绿色线为氢键(HB)、红色线为疏水相互作用(HI)、深蓝色线为π-π相互作用;

C图 多物种序列比对显示Y146、F274等互作位点在人、猿、猴、小鼠等NTCP中高度保守;

D图 定位3个高结合能互作位点(A-C)，其中位点C由NTCP的Y146(EL2)、F274(TM8b)与bulevirtide的W41(string结构)形成;

E图 计算位点A-C的结合能，位点C结合能最高(45 kJ/mol);

F图 显示位点C的“芳香族氨基酸三角”结构(Y146-F274-W41);G图突变模拟显示，Y146A、F274A、W41G单突变分别使结合能降低32.7、22.7、37.1 kJ/mol，双突变或三突变结合能下降更显著。

图2：myr-preS1与NTCP分子相互作用的时间分辨MD模拟

A图 比对bulevirtide与HBV基因型D的myr-preS1序列，二者plug结构(2-20aa)和string结构(21-48aa)核心互作位点高度保守;

B图 统计20组MD模拟(每组100ps)中bulevirtide各氨基酸与NTCP的互作次数，显示plug结构的N4、F13、F14及string结构的W32、W41为主要互作位点，且仅W41不与NTCP的胆汁酸结合通道重叠。

图3：NTCP-Y146A/F274A双突变体的细胞膜定位与表达

A图 免疫荧光结果显示，NTCP野生型(NTCPwt)与双突变体均通过抗FLAG抗体(绿色)定位于HEK293细胞膜，细胞核经Hoechst 33342染色(蓝色)，63倍放大的Z-stack成像证实二者定位一致;

B图 Western blot分析显示，经膜蛋白提取和PNGase F去糖基化后，NTCPwt与双突变体在膜组分中均检测到40kDa左右的特异性条带，胞质组分中无条带，GAPDH作为内参证实上样量一致，未转染NTCP的HEK293细胞无特异性条带。

图4：NTCP-Y146A/F274A双突变体的胆汁酸转运功能与myr-preS1结合能力

A图 荧光成像显示，NTCPwt与双突变体HEK293细胞对荧光胆汁酸3α-NBD-TCA(绿色)的摄取量相当，而对Alexa 568标记的myr-preS1(myr-preS1-AX568，红色)的结合量差异显著;

B图 定量检测25μM 3α-NBD-TCA的转运率，双突变体与NTCPwt无统计学差异(p>0.05)，未转染NTCP的HEK293细胞转运率显著更低(p<0.01);

C图 浓度依赖性结合实验显示，5-160nM myr-preS1-AX568与双突变体的结合量均显著低于NTCPwt(p<0.01)，160nM时双突变体的结合量仅为NTCPwt的25%。

图5：野生型与W41G突变体myr-preS1对NTCP转运功能及结合能力的抑制作用

A图 竞争性结合实验显示，250nM野生型myr-preS1可完全阻断myr-preS1-AX568与NTCPwt的结合，而W41G突变体即使1000nM也无法完全阻断，且各浓度下W41G的阻断效率均显著低于野生型(p<0.01);B图 检测对[³H]TCA(放射性标记牛磺胆酸)转运的抑制作用，野生型myr-preS1的IC50为111-221nM，W41G突变体的IC50为386-397nM，二者差异显著(p<0.01);C图 检测对[³H]preS1(放射性标记myr-preS1)结合的抑制作用，野生型myr-preS1的IC50为99-168nM，W41G突变体的IC50为298-422nM，证实W41G结合亲和力显著下降(p<0.01)。

图6：NTCP-Y146A/F274A双突变体与preS1-W41G突变体对体外HBV感染的影响

A图 评估HepG2细胞转染NTCPwt或双突变体后的功能表达，荧光胆汁酸3β-NBD-TCA摄取实验显示约45%细胞具有胆汁酸转运活性，抗FLAG免疫荧光显示约10%细胞表达NTCP，二者无组间差异(p>0.05);B图 体外HBV感染实验显示，转染NTCPwt的HepG2细胞上清HBeAg阳性，且野生型myr-preS1呈浓度依赖性抑制感染(10nM即显著降低HBeAg，p<0.05);转染双突变体的HepG2细胞上清HBeAg阴性，完全抵抗HBV感染;preS1-W41G突变体仅在500nM时轻度抑制感染(HBeAg降低50%)，且抑制效率显著低于同浓度野生型(p<0.05)。

研究结论

本研究证实，myr-preS1的W41与NTCP的Y146/F274通过π-π堆叠及疏水作用形成高结合能相互作用位点，该位点对HBV入侵肝细胞至关重要——NTCP Y146A/F274A双突变体虽保留胆汁酸转运功能但完全阻断HBV感染，preS1 W41G突变体结合NTCP能力及抑制感染效率显著下降。由于该位点与NTCP的胆汁酸结合/转运通道空间分离，为基于结构开发病毒选择性HBV/HDV进入抑制剂提供了理想靶点，可避免现有抑制剂干扰胆汁酸代谢的副作用，为慢性HBV/HDV感染的安全治疗开辟新方向。