低成本获取皮肤成纤维细胞！机械分离法从包皮中提取 HDFs，助力衰老研究

原代人真皮成纤维细胞(HDFs)是研究皮肤衰老的重要工具，但传统酶解法存在成本高、细胞活力低、操作复杂等问题。在此背景下，来自印度尼西亚帕德贾贾兰大学的 团队在《BMC Research Notes》(2025, 18:311)发表研究，建立了一种高效、低成本的机械分离法，从包皮组织中获取 HDFs。该方法无需酶解，操作简单，可在资源有限的实验室开展，分离的 HDFs 能稳定传代至第 8 代(P8)，并保留成纤维细胞表型，为复制性衰老研究提供了可靠模型。

本研究旨在开发一种无需酶解的机械分离 protocol，从包皮组织中分离原代 HDFs。核心步骤包括：包皮样本消毒后，机械分离真皮层并剪碎为 1-2 mm 组织块，贴壁培养;通过传代(P3 至 P8)诱导复制性衰老;采用免疫荧光检测 ACTIN、VIMENTIN 蛋白，RT-qPCR 检测 SERPINH1 基因表达进行细胞鉴定。结果显示，机械分离的 HDFs 呈梭形，表达成纤维细胞特异性标志物，可传代至 P8 并出现衰老表型，证实该方法适用于皮肤内在衰老研究。

研究背景

HDFs 是真皮的主要细胞，参与胶原合成和组织修复，其复制性衰老模型是研究皮肤自然衰老的经典工具。传统酶解法(如胶原酶、胰蛋白酶)依赖昂贵试剂，且酶的不当使用会导致细胞活力下降，尤其在资源有限地区难以推广。

包皮作为包皮环切术后的生物废弃物，来源丰富(全球男性环切率高)，伦理争议小，是获取 HDFs 的理想样本。机械分离法无需酶解，可降低成本并简化操作，但此前缺乏标准化 protocol。本研究优化了机械分离流程，验证了其获取的 HDFs 在复制性衰老研究中的适用性，填补了低成本、易操作的原代 HDFs 分离方法的空白。

实验结果

图 1：HDFs 机械分离与传代流程示意图

该图展示实验步骤：包皮样本经碘伏、70% 酒精消毒后，去除尿道端(含菌风险高)，机械分离真皮层(去除脂肪和表皮)，剪碎为 1-2 mm 组织块;组织块接种于 T-25 flask，15 分钟贴壁后加培养基培养;细胞融合至 80-90% 时，用 0.05% 胰蛋白酶传代，重复至 P8。

图 2：HDFs 的形态与鉴定结果

该图展示 HDFs 的生长与表型变化：图 2a 显示组织块培养第 7、10、13 天的细胞生长，第 10 天首次观察到梭形 HDFs 从组织块边缘迁出;图 2b 对比 P3 和 P8 的形态，P3 细胞呈细长梭形，两端尖细，中央直径较大，P8 细胞出现形态异常(扁平、不规则)，群体异质性增加;图 2c 的免疫荧光显示，ACTIN(红色)主要分布在细胞边缘，VIMENTIN(绿色)集中在核周并向边缘延伸，两者均与 DAPI(核染色)共定位;定量分析显示 P8 的 VIMENTIN 强度显著高于 P3(p=0.027)，ACTIN 无显著变化;图 2d 的 RT-qPCR 显示 SERPINH1 在 P8 的表达较 P3 呈上升趋势(1.80 倍);图 2e 显示细胞面积和核面积在 P3 与 P8 间无显著差异，但核面积均值略有增加。

研究结论

本研究建立的包皮 HDFs 机械分离 protocol 具有以下优势：无需酶解，降低成本且简化操作，适用于资源有限环境;分离的 HDFs 呈典型梭形，表达 ACTIN、VIMENTIN 和 SERPINH1 等成纤维细胞标志物;可稳定传代至 P8，P8 细胞出现 VIMENTIN 显著升高、形态异常等衰老表型，适合复制性衰老研究。局限性包括成人包皮因脂肪多难以分离、传代中存在污染风险等。该方法为皮肤内在衰老研究提供了经济、可靠的体外模型。