新型人脑类器官培养方案实现近100%神经上皮形成效率

人脑类器官(human cerebral organoids，hCOs)作为研究人脑发育和疾病的重要体外模型，为神经科学研究提供了前所未有的机会。自从首个人脑类器官成功构建以来，研究者们不断致力于改进和优化制备方案。传统的类器官制备方法通常分为非引导型和引导型两种策略：非引导型方案能够自发产生不同脑区的类器官结构，而引导型方案则通过添加特定的模式化因子来产生特定脑区的类器官。

然而，现有的制备方法普遍存在一些技术挑战和限制。传统方案通常需要将多能干细胞进行解离处理，随后形成胚胎体(embryoid bodies，EBs)聚集，这一过程不仅操作复杂，而且可能导致细胞损伤和发育不一致性。此外，许多方案还需要使用基质胶包埋，进一步增加了操作的复杂性和成本。这些技术障碍限制了类器官制备的效率和重现性，影响了其在基础研究和药物筛选中的广泛应用。

近期，发表在Star Protocols期刊上一篇题为Protocol for generating human cerebral organoids from two-dimensional cultures of pluripotent stem cells bypassing embryoid body aggregation的研究论文旨在开发一种更简化、高效的人脑类器官制备方法，通过直接从二维多能干细胞培养物诱导神经分化，避免传统的细胞解离和胚胎体聚集步骤，从而提高类器官的产生效率和质量一致性。

图示描述

1，神经诱导和神经上皮结构形成的优化：研究建立了直接从二维多能干细胞培养物进行神经诱导的方法，通过使用包含双SMAD抑制因子和CHIR99021的神经诱导培养基，成功实现了近100%的神经上皮结构形成效率。在神经诱导阶段(第0-7天)，多能干细胞表达Ki67、Oct4和Sox2等标记物，随后在神经诱导培养基作用下逐渐形成三维神经上皮结构。这些结构具有连续的细胞层特征，边缘清晰且呈现光学透明区域。该方法避免了传统的细胞解离和胚胎体聚集步骤，大大简化了操作流程并提高了成功率。

图1 实验流程示意图

2，类器官分化和成熟过程的表征：在神经上皮结构形成后，通过转换至分化培养基(第12-21天)和维持培养基(第19天至3个月)，类器官经历了完整的分化和成熟过程。研究发现，成熟的类器官呈现多个脑室区(ventricular zones，VZs)，这些区域富含神经前体细胞，表达Ki67和Sox2标记物。脑室区周围分布着不同成熟阶段的神经元，包括表达DCX的迁移神经母细胞、表达βIII-微管蛋白的分化神经元、表达MAP2的成熟神经元以及表达突触囊泡蛋白Synapsin I的功能性神经元。全景三维重建显示每个类器官含有多个脑室区，证明了该方案的稳健性。

3，多种脑细胞类型的成功分化：该方案不仅能够产生神经元，还成功分化出大脑中存在的其他重要细胞类型。通过免疫荧光染色和RT-qPCR分析，研究证实了星形胶质细胞(GFAP+和S100β+)在培养2个月时的出现，少突胶质前体细胞(CNPase+)在培养1个月时开始表达，以及小胶质样细胞(IBA1+)的存在。此外，还检测到内皮样细胞的标记物VEGFR2和CD31的表达。基因表达分析显示，OLIG2和NG2在分化阶段增加表达，随后在成熟过程中下降，而成熟少突胶质细胞标记物如GALC和PLP1则持续增加，表明少突胶质前体细胞正在向成熟谱系发展。

图 2 人多能干细胞(hPSCs)的表征及神经上皮结构的形成

4，细胞间通讯网络的复杂性分析：通过单细胞RNA测序数据和CellChat计算工具分析，研究揭示了类器官中不同细胞类型之间复杂的通讯网络。分析显示兴奋性神经元、中间神经元、少突胶质前体细胞、星形胶质细胞和不同类型的放射状胶质细胞之间存在广泛的信号通路交互。特别是在谷氨酸和GABA信号通路中，不同细胞类型作为信号发送者、接收者、中介者或影响者发挥着不同的作用，这种复杂的细胞间通讯网络反映了类器官在模拟真实大脑发育和功能方面的潜力。

5，方案效率和重现性的验证：该研究使用了人胚胎干细胞(AND-2)和诱导多能干细胞(IC-Ctrl1-F-iPS-4F-1和IC-Ctrl2-F-iPS-4F-1)进行验证，结果显示不同细胞系均能获得相似的结果。重要的是，97%的神经上皮结构能够成功发育为功能性类器官，这一效率远高于传统方法。超微结构分析进一步证实了星形胶质细胞、少突胶质前体细胞和小胶质样细胞的存在，为该方案的可靠性提供了额外的形态学证据。

图 3 贴壁神经上皮结构的筛选与转移以获得悬浮状态的神经上皮结构

全文总结

该研究开发的直接从二维多能干细胞培养物产生人脑类器官的方案具有重要的科学价值和应用前景。首先，该方法显著简化了类器官制备流程，避免了传统方法中复杂的细胞解离、胚胎体聚集和基质胶包埋步骤，不仅降低了技术门槛和操作成本，还提高了实验的重现性和标准化程度。其次，近100%的高效率神经上皮结构形成率为大规模类器官制备和高通量筛选应用奠定了基础。

该研究还为理解人脑发育的细胞和分子机制提供了新的模型系统。类器官中多种脑细胞类型的成功分化以及复杂的细胞间通讯网络的建立，使其成为研究神经发育、神经退行性疾病和精神疾病的理想平台。这对于药物筛选、疾病建模和再生医学研究具有重要意义。此外，该方案的建立也为类器官技术的进一步发展提供了新的思路和方法学基础。