Florent Ginhoux利用脑类器官模拟HDLS

遗传性弥漫性白质脑病伴轴索球样小体(HDLS)，也称为成人发病性白质营养不良伴轴索球样小体和色素性胶质细胞(ALSP)，是一种罕见的遗传性常染色体显性神经退行性疾病。该疾病以斑片状轴索肿胀(球样小体)和脱髓鞘为特征，导致脑白质改变。尽管缺乏详细的流行病学数据，但2021年估计全球约有25万人受此疾病影响。

十多年来，科学界已知HDLS是由影响集落刺激因子-1受体(CSF-1R)的突变引起的，这些突变最常发生在酪氨酸激酶结构域(TKD)，导致对CSF-1的自磷酸化反应降低，进而引起下游信号传导受损。这些突变最深刻地影响微胶质细胞——大脑中专门的常驻巨噬细胞，它们在大脑发育和稳态以及多种神经炎症和神经退行性疾病中发挥关键作用。HDLS患者的微胶质细胞数量少、体积小，在新皮质中分布异常，与健康对照组相比，表达低水平的稳态标志物P2RY12和高水平的炎症标志物CD68。

既往研究HDLS病理生理学的努力使用了各种方法，但都存在局限性。啮齿动物模型虽然产生了有价值的见解，但未能完全复制人类疾病表型。为克服这些种属特异性限制，浙江大学医学院王康/上海市免疫学研究所Florent Ginhoux团队从两名HDLS患者生成了人类诱导多能干细胞(iPSC)衍生的巨噬细胞，并利用它们创建含微胶质细胞的自体脑类器官系统，以表征自然发生的CSF-1R突变对微胶质细胞功能的影响。研究结果以题Modeling hereditary diffuse leukoencephalopathy with axonal spheroids using microglia-sufficient brain organoids发布在Elife期刊。

图示描述

1，iPSC细胞系的建立和表征：研究团队成功从两名HDLS患者的皮肤活检样本中分离出真皮成纤维细胞，经过约4周培养后重编程为iPSC。重编程后4-5周观察到iPSC样集落出现，经免疫荧光验证表达多能性标志物SOX2、OCT4、TRA-1-60和SSEA-4，核型分析正常。随后使用CRISPR/Cas9技术生成了基因校正的同源对照细胞系(IsoHD1和IsoHD2)，未检测到脱靶事件，成功建立了患者来源的HDLS iPSC及其相应的同源iPSC对照。

图1 HDLS患者iPSC系的生成与表征

2，iMac的生成和功能表征：利用无血清方案成功从患者来源的iPSC细胞系分化出原始微胶质细胞样巨噬细胞(iMac)。尽管HDLS突变降低了CSF-1R对其配体的敏感性，但仍能成功生成iMac。流式细胞术证实其表达CD45和CD14，Giemsa染色显示供体间形态学相似。功能上，所有iMac培养物均能摄取PE标记的珠子，吞噬pHrodo珠的水平在各培养物间相当。然而，在CSF-1存在下的存活实验显示，即使在高浓度CSF-1条件下，突变细胞的存活率也相对较低，而低CSF-1水平就能使更多的同源细胞存活，证实了CSF-1R突变对细胞存活的影响。

图2 患者iPSC衍生巨噬细胞的生成与表征

3，转录组和代谢谱分析：主成分分析显示突变型和同源型iMac之间的基因表达模式存在显著差异。HD1突变型iMac表现出更活跃的状态，高表达与增殖和抗病毒防御反应相关的基因，而同源HD1 iMac高表达与趋化因子相关反应和白细胞迁移相关的基因。HD2来源的iMac也观察到类似的转录组谱。代谢分析显示，CSF-1R突变的iMac糖酵解功能显著增加，糖酵解能力和储备均增强。氧消耗率测定表明，突变型iMac的基础呼吸、ATP产生和最大呼吸能力趋向于更高值，特别是HD2突变细胞在所有三个生物能参数上都达到统计学显著差异。

图3 突变型和同源对照imac具有不同的基因表达谱

4，炎症因子产生和凋亡细胞清除：为模拟凋亡细胞清除需求，研究团队将iMac与UV照射的神经元SH-SY5Y细胞共培养。两种iMac细胞系均能有效吞噬凋亡但非对照的SH-SY5Y细胞。在与凋亡细胞共培养8小时后测量促炎和抗炎细胞因子基因表达，发现HD1和HD2的CSF-1R突变iMac在暴露于凋亡细胞时IL-1β转录显著特异性增加。有趣的是，所有CSF-1R突变iMac组在基线时大多数促炎细胞因子的转录水平都较高，反映了其活化/反应性转录谱，基因编辑恢复CSF-1R足以逆转这种炎症表型。

图4 当用凋亡神经元细胞探测时，iMac的细胞因子分析显示IL-1β水平上调

5，脑类器官共培养模型的建立：成功建立了iPSC衍生前脑类器官与自体iMac的共培养系统。3D成像显示表达微胶质细胞标志物IBA-1的iMac主要位于类器官表面。在23天共培养后，iMac分化为微胶质细胞样细胞，表现为IBA-1表达、分枝形态以及转录组谱显示与典型微胶质细胞功能相关的生物学通路上调，包括中枢神经系统和大脑发育、突触组织、神经元组织和发育以及神经发生等。

图5 在与前脑类器官共培养时，imac分化为小胶质细胞样细胞

6，神经元调节功能受损：共培养实验显示微胶质细胞样细胞能够调节类器官内的神经发生。IsoHD1类器官与IsoHD1 iMac共培养导致神经元群体显著减少，而与突变HD1 iMac共培养的神经元减少程度较小且不显著。转录组分析显示，HD2突变iMac共培养的神经元中与线粒体呼吸相关的基因表达上调，而同源iMac共培养的神经前体细胞中也观察到类似现象，表明突变的iMicro能够改变非突变同源类器官细胞的状态，这一过程在体内可能对大脑发育和稳态产生深远的长期影响。

图6 共培养导致类器官内神经元调节受损

全文总结

本研究建立了基于患者来源iPSC的HDLS人体化疾病模型，为理解这一罕见神经退行性疾病的发病机制提供了重要平台。研究揭示了CSF-1R突变导致微胶质细胞代谢重编程，向糖酵解途径偏移，并产生活化的炎症表型，特别是IL-1β的高水平产生。这些发现为开发针对IL-1β的治疗策略提供了理论依据，如使用靶向IL-1β的人单克隆抗体canakinumab。该模型系统成功重现了HDLS的关键病理特征，包括微胶质细胞功能异常和对神经元群体调节的损害，为未来药物筛选和治疗开发奠定了基础。研究还证明了含微胶质细胞的患者来源脑类器官方法在研究其他神经退行性疾病机制方面的潜在价值，为精准医学和个体化治疗策略的发展开辟了新途径。