CAFs 研究完整方案出炉，助力乳腺癌微环境机制解析

肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)作为肿瘤微环境的主要成分，在乳腺癌进展中起关键作用，但原代 CAFs 存在传代有限、表型不稳定等问题。在此背景下，来自意大利都灵大学的团队在《Journal of Visualized Experiments》(2025, 221:e68364)发表研究，建立了一套完整的小鼠乳腺肿瘤 CAFs 研究方案：包括从肿瘤中分离 CAFs、通过病毒转导实现永生化、基因敲除调控、体外功能验证(增殖、迁移、侵袭)、体内肿瘤生长及转移评估，同时结合转录组分析和自主开发的 web 工具(MetaLCM)解析基质特异性基因签名。该方案为 CAFs 的分子机制研究和治疗靶点筛选提供了稳定可靠的工具。

本研究旨在建立标准化的小鼠乳腺肿瘤 CAFs 研究平台，以解析其促肿瘤功能及分子机制。

核心步骤包括：

从乳腺肿瘤分离原代 CAFs，通过 SV40 大 T 抗原介导的病毒转导实现永生化(iCAFs);利用慢病毒 shRNA 进行基因敲除;

通过条件培养基(CM)处理肿瘤细胞评估体外促增殖、迁移和侵袭能力;在 BALB/c 小鼠中进行肿瘤细胞与 iCAFs 共注射，监测原发瘤生长和肺转移;

结合 RNA-seq 定义 CAFs 特异性基因签名(如 STAT3 调控签名)，并通过 MetaLCM 工具分析人类激光捕获显微切割(LCM)样本的基质转录组。该方案可稳定实现 CAFs 的功能研究和跨物种验证。

研究背景

乳腺癌的进展高度依赖肿瘤微环境(TME)，CAFs 作为 TME 的主要细胞，通过 ECM 重塑、血管生成、免疫抑制等促进肿瘤生长和耐药。然而，原代 CAFs 在体外易衰老，传代能力有限，限制了长期功能研究;现有模型难以兼顾 CAFs 的异质性和遗传可操作性。

小鼠模型因能模拟内源性 TME 和免疫系统而被广泛应用，但 CAFs 的功能研究缺乏标准化流程。本研究针对这些局限，优化了 CAFs 的分离、永生化和功能验证方法，结合转录组分析和生物信息学工具，实现从细胞到动物再到人类样本的跨层次研究，填补了 CAFs 研究中 “体外功能 - 体内验证 - 临床关联” 的方法学空白。

实验结果

图 1：CAFs 的体外促肿瘤功能验证

该图展示 iCAFs 的体外功能评估结果：通过超激活(s.a.)iCAFs(经肿瘤细胞 CM 处理)的条件培养基(CM)处理 4T1 乳腺癌细胞，发现其增殖能力显著增强(第 48 小时 OD 值为对照组的 2.5 倍);迁移和侵袭能力分别提高约 2 倍和 1.5 倍(p<0.01)。结果证实 iCAFs 可通过分泌可溶性因子促进肿瘤细胞的恶性表型，且该方案能稳定检测 CAFs 的体外促肿瘤活性。

图 2：CAFs 的体内促肿瘤和转移能力验证

该图为体内共注射实验结果：将 4T1 细胞与 s.a. iCAFs(比例 1:3)共注射到 BALB/c 小鼠第 4 乳腺脂肪垫，第 10 天原发瘤体积达 85 mm³，显著大于单独注射组(54 mm³);肿瘤重量增加约 1.5 倍，肺转移灶面积占比提高约 5 倍(p<0.0001)。证实 iCAFs 在体内可显著促进肿瘤生长和转移，重现了 CAFs 在 TME 中的促癌作用。

图 3：STAT3 调控的 CAFs 基因签名及人类基质验证

该图展示基因签名的解析与跨物种验证：通过 RNA-seq 鉴定 STAT3 敲除后 CAFs 中下调的基因，定义 STAT3 签名;利用 MetaLCM 工具分析人类 LCM 样本，发现该签名中的 MMP13、MMP3、LGI2 和 TIMP1 在肿瘤基质中显著上调(一致的 logFC 方向)。结果表明 CAFs 的 STAT3 调控通路在人类乳腺癌基质中保守，为临床转化提供了分子依据。

研究结论

本研究建立的 CAFs 研究方案具有以下优势：① 永生化 iCAFs 克服了原代细胞的传代限制，保留促肿瘤功能;② 体外 CM 实验和体内共注射模型可分层验证 CAFs 的促增殖、迁移和转移能力;③ 转录组分析结合 MetaLCM 工具实现了从小鼠 CAFs 到人类肿瘤基质的跨物种关联，鉴定出 STAT3 调控的基质特异性签名(如 MMP 家族)。该方案为解析 CAFs 的分子机制、筛选治疗靶点提供了标准化工具，局限性在于永生化可能改变部分表型，需与原代 CAFs 对照验证。