实时 “捕捉” 细菌应激信号 (p) ppGpp，解锁代谢调控新机制

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具。

基本信息

英文标题：Analysis of (p)ppGpp metabolism and signaling using a dynamic luminescent reporter

中文标题：利用动态发光报告系统分析 (p) ppGpp 代谢与信号通路

发表期刊：《PLOS Genetics》

影响因子：3.7

作者单位：

1. Department of Microbiology and Immunology, Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, New York, New York, United States of America

2. Department of Microbiology, University of Washington, Seattle, Washington, United States of America

作者信息：

Molly Hydorn¹, Sathya Narayanan Nagarajan¹, Elizabeth Fones², Caroline S. Harwood², Jonathan Dworkin¹*

研究背景

(p) ppGpp 是细菌应对营养限制的关键信号分子，调控代谢重编程与应激耐受，但传统检测依赖 ³²P 标记或 LC-MS 等繁琐方法，无法动态监测活细胞变化;体外观察到的 (p) ppGpp 合成酶变构调节、Rel 水解酶活性影响，缺乏体内验证;且 (p) ppGpp 与下游生理过程的时间关联不明。为此，研究以枯草芽孢杆菌为模型，基于 (p) ppGpp 敏感核糖开关构建萤火虫荧光素酶报告系统 RsFluc，实现对 (p) ppGpp 丰度的实时灵敏检测，填补研究空白。

研究方法

RsFluc 报告系统构建与参数定义

将 (p) ppGpp 敏感核糖开关插入诱导型启动子 Pₕᵧₚₑᵣₛₚₐₙₖ与萤火虫荧光素酶基因间，整合至枯草芽孢杆菌 sacA 位点;同步表达 GAPDH 启动子调控的红色荧光素酶作为内参，校正细胞活力差异;定义 nIL1LA(绿色与红色荧光素酶活性比)、Ind-IL1LA(处理组与未处理组 nIL1LA 比)评估 (p) ppGpp 诱导效果，并构建核糖开关突变体及 (p) ppGpp 合成酶三重缺失株作为对照。

菌株与化学处理条件

所有菌株衍生自 B. subtilis 168 trpC2，包括合成酶突变株(relA-D264G、sasB-F42A)、水解酶突变株(rel-D78A);通过氨基酸下调(重悬于无氨基酸培养基)、50 ng/mL 莫匹罗星处理(抑制 tRNA 合成酶)、葡萄糖 - 阿拉伯糖代谢转换(观察碳源耗尽响应)，诱导 (p) ppGpp 合成以验证报告系统。

检测方法

用 Tecan 仪器每 10 分钟检测 OD₆₀₀与发光值，计算 RLU/OD 反映 (p) ppGpp 水平;HPLC-MS 定量细胞提取物中 (p) ppGpp 与 GTP 浓度，以 ¹⁵N 标记核苷酸为内标;荧光原位杂交(FISH)验证核糖开关下游 mRNA 转录通读效率;Click-iT OPP 标记法结合荧光显微镜，定量蛋白质合成活性。

功能验证实验

比较不同合成酶缺失 / 突变株与野生型的 RsFluc 活性，明确 RelA、SasA/SasB 的体内贡献;检测变构位点突变株(relA-Y200A、sasB-F42A)的 (p) ppGpp 响应，验证变构调节功能;通过诱导表达 Rel-D78A(水解酶失活)，分析 Rel 水解酶对 (p) ppGpp 动态的影响;构建氨基酸合成基因的 luc 融合报告，关联 RsFluc 信号与基因表达的时间相关性。

实验结果

图1：RsFluc 报告系统的特异性验证

A 图 为载体结构(Pₕᵧₚₑᵣₛₚₐₙₖ- 核糖开关 - luc)，

B 图 显示野生型 RsFluc 在生长过渡期(~220 分钟)出现显著发光峰，(p) ppGpp⁰株(∆relA∆sasA∆sasB)、核糖开关双突变株发光显著减弱;

C 图 HPLC-MS 验证：ppGpp 浓度(黑色)与 RsFluc 发光(蓝色)完全同步，峰值均在～180 分钟;

D 图 亚型特异性：ppGpp 敏感型报告(RsFlucˡⁱᵥₖ)与野生型 RsFluc 趋势一致，pppGpp 敏感型报告(RsFlucⁿᵃᵗᴬ)响应延迟。

图2：RsFluc 对 (p) ppGpp 诱导条件的响应

A 图 氨基酸下调：RsFluc(黑色)在下调后～30 分钟出现发光峰，核糖开关突变体(蓝色)无响应;

B 图 莫匹罗星处理：50 ng/mL 处理 60 分钟后，RsFluc 发光显著升高(p<0.05)，突变体无变化;

C 图 代谢转换：葡萄糖耗尽时(~240 分钟)，RsFluc 出现发光峰(蓝色)，单一葡萄糖组(黑色)无响应;

D 图 purE 启动子验证：(p) ppGpp 增强 PurR 结合以抑制 purE 转录，故 RsFluc 峰值(黑色)与 PurE-luc 谷值(橙色)完全同步。

图3：(p) ppGpp 合成酶的体内贡献

A 图 常规生长：relA-D264G 株(Rel 合成酶失活，蓝色)RsFluc 活性与三重缺失株(红色)接近，∆sasA(绿色)、∆sasB(橙色)仅轻微延迟响应;

B 图 氨基酸下调：relA-D264G 株(蓝色)与∆sasA∆sasB 株(棕色)均显著减弱发光，且生长恢复受阻。

图4：变构调节对 (p) ppGpp 代谢的体内作用

A 图 常规生长：relA-Y200A(Rel 变构位点突变，紫色)、sasB-F42A(SasB 变构位点突变，蓝色)株 RsFluc 响应延迟;

B 图 氨基酸下调：两突变株均延迟发光峰出现，且生长恢复缓慢。

图5：Rel 水解酶活性对 (p) ppGpp 动态的影响

A 图 为杆菌肽诱导表达系统(Pᵢₛₒₗ调控 relA 或 rel-D78A);

B 图 发光曲线：表达 rel-D78A(水解酶失活，红色)的 (p) ppGpp⁰株发光峰更宽、持续时间延长，表达野生型 relA(蓝色)的发光峰尖锐。

图6：氨基酸可用性对 (p) ppGpp 丰度的影响

A 图 Casamino acids(CAA)浓度：0.02% CAA 组(绿色)RsFluc 峰值延迟至～300 分钟，0.005% CAA 组(蓝色)峰值提前至～180 分钟;

B 图 无氨基酸补充：RsFluc 活性虽低，但显著高于核糖开关突变体(蓝色)，反映基础 (p) ppGpp 水平。

图7：(p) ppGpp 与氨基酸合成基因表达的时间关联

A 图 野生型：serA-luc(蓝色)、ilvD-luc(绿色)、metE-luc(红色)的发光峰与 RsFluc(黑色)完全同步;

B 图 relA-D264G 株：所有基因报告的发光均显著减弱。

图8：(p) ppGpp 与蛋白质合成的 temporal 关系

A 图 生长速率：RsFluc 峰值(蓝色)与生长速率下降(黑色)同步;

B-D 图 OPP 标记：野生型细胞在 RsFluc 峰值时(TP2)的翻译活性(C 图)较 TP1 下降，而 (p) ppGpp⁰株(D 图)翻译活性升高。

研究结论

RsFluc 报告系统的有效性：该系统可实时、灵敏监测活细胞内 (p) ppGpp 动态，特异性达 94%，且能区分 ppGpp/pppGpp 亚型，解决传统方法无法动态分析的局限;2. 关键机制的体内验证：RelA 是常规生长中 (p) ppGpp 合成的主效酶，SasA/SasB 在氨基酸限制时协同作用;Rel 的 Y200 位点、SasB 的 F42 位点介导的变构调节，及 Rel 水解酶活性，是体内 (p) ppGpp 代谢的核心调控机制;3. (p) ppGpp 的调控时效性：(p) ppGpp 与靶基因表达、蛋白质合成的时间高度同步，证实其直接调控作用，为细菌 “ stringent 响应快速启动” 提供关键实验证据。