乳腺癌细胞 ICAM-1：不影响肿瘤生长与 CTL 杀伤，却靠中性粒细胞抑制肺转移

同源异体小鼠肿瘤模型是免疫肿瘤学(I/O)研究中不可或缺的临床前模型，但它们对免疫检查点抑制剂(ICIs)的反应有限，这可能是由于它们的固有低免疫原性。为了解决这一问题，研究人员通过将鸡卵清蛋白(OVA)这一高度免疫原性的蛋白质表达到同源异体肿瘤细胞中，开发了新的免疫原性同源异体模型。这些模型，如DC2.4-OVA和B16-OVA，显示出比它们的亲本细胞系更慢的肿瘤生长速度，这可能是由于免疫介导的排斥反应。更重要的是，这些OVA表达的模型对ICIs，特别是抗PD-1治疗，表现出更高的敏感性，这表明它们在增强T细胞介导的免疫反应方面具有潜力。此外，通过过继T细胞转移实验，研究人员验证了这些模型中存在肿瘤特异性记忆T细胞。这些结果表明，OVA工具细胞不仅增强了对ICIs的反应，而且为临床前免疫治疗评估提供了新的、具有更高免疫原性的同源异体模型，这对于I/O研究具有重要的意义。

基本信息

英文标题：ICAM-1 on Breast Cancer Cells Suppresses Lung Metastasis but Is Dispensable for Tumor Growth and Killing by Cytotoxic T Cells

中文标题：乳腺癌细胞表面 ICAM-1 抑制肺转移但不影响肿瘤生长及细胞毒性 T 细胞介导的杀伤作用

发表期刊：《Frontiers in Immunology》

影响因子：5.9

作者单位：

1. Department of Immunology, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel

2. Cancer Research Center, Sheba Medical Center, Ramat-Gan, Israel

3. Department of Biology, Institute of Molecular Health Sciences, ETH Zurich, Zurich, Switzerland

作者信息：

Ofer Regev, Marina Kizner, Francesco Roncato

研究背景

ICAM-1(CD54)是免疫球蛋白超家族成员，通过结合白细胞 β₂整合素(如 LFA-1、Mac-1)参与细胞粘附与免疫调控，在肿瘤中的作用存在争议：部分研究认为其促进乳腺癌侵袭、循环肿瘤细胞(CTC)聚集及转移，也有研究提示其可能增强免疫细胞对肿瘤的杀伤。然而，ICAM-1 在乳腺癌原发灶生长、CTL 介导的杀伤及肺转移中的体内功能及机制尚未明确。

本研究以 C57BL/6 来源的 luminal B 型乳腺癌细胞 E0771 为模型，通过 CRISPR/Cas9 敲除 ICAM-1，结合自发 / 实验性肺转移模型，探究 ICAM-1 对乳腺癌生长、CTL 杀伤及肺转移的影响，明确其通过中性粒细胞依赖的方式抑制肺转移，为乳腺癌转移干预提供新视角。

研究方法

细胞系与基因编辑：

采用 luminal B 型乳腺癌细胞 E0771(HER2⁺、ER-α⁺)，通过 CRISPR/Cas9 靶向 ICAM-1 第一外显子(2 条 sgRNA)，流式分选获得 ICAM-1 敲除株(ICAM-1 KO)及野生型对照株;构建 E0771-OVA 细胞株(稳定表达卵清蛋白模型抗原);细胞培养于含 10% FBS 的 DMEM 培养基，定期验证支原体阴性。

动物模型与转移实验：

自发转移模型：将 3×10⁵ E0771 细胞(对照 / ICAM-1 KO)接种于 C57BL/6 小鼠乳腺脂肪垫，2-3 周后切除原发瘤，再培养 2-3 周后检测肺转移;

实验性转移模型：将 1×10⁴ CMTMR 标记的 E0771 细胞经眶后静脉注射，14 天后检测肺转移灶;

免疫调控模型：采用 FOXP3-DTR-GFP 小鼠，腹腔注射白喉毒素(DTx) depletion Treg;OT-I 小鼠来源的 CTL(特异性识别 OVA-SIINFEKL 肽)经静脉注射，评估对 E0771-OVA 的杀伤。

分子与细胞检测：

Western blot 检测 ICAM-1、ER-α 等蛋白;FACS 分析肿瘤微环境(TME)免疫细胞组成(DC、TAM、中性粒细胞、Treg 等);光片显微镜(LSM)观察肺内癌细胞分布(CD31 标记血管);H&E 染色计数肺转移灶;RNA 免疫沉淀(RIP)验证 ICAM-1 与配体结合;体外杀伤实验检测 CTL 或中性粒细胞对 E0771 的杀伤效率(荧光素酶活性或流式计数)。

免疫细胞功能实验：

从 E0771 荷瘤小鼠脾脏分离中性粒细胞(肿瘤诱导中性粒细胞 TENs)，通过过继转移实验验证其对肺内癌细胞的杀伤; depletion 实验(抗 Ly6G 抗体清除中性粒细胞、抗 CD8 抗体清除 CTL)明确免疫细胞类型的作用。

实验结果

图1：ICAM-1 敲除不影响 E0771 细胞生长与 TME 组成

A 图 体外增殖曲线显示，ICAM-1 KO 与对照 E0771 早期生长一致，汇合后 KO 株略快;

B 图 依托泊苷处理后，两组细胞生长抑制率无显著差异，提示 ICAM-1 不影响化疗敏感性;

C 图 体内实验中，1×10³ 对照 / ICAM-1 KO 细胞接种乳腺脂肪垫，13-21 天肿瘤体积无差异;

D 图 免疫组化证实对照 E0771 在体内维持 ICAM-1 表达;

E 图 FACS 分析显示，两组肿瘤 TME 中 DC、B 细胞、TAM、中性粒细胞、Treg 等免疫细胞比例无显著差异;

F-G 图肿瘤引流淋巴结(TdLN)中 DC、B 细胞略减少，脾脏免疫细胞组成无差异。

图2：Treg depletion 与同源肿瘤预植入对 E0771 的杀伤不依赖 ICAM-1

A 图 实验设计：FOXP3-DTR-GFP 小鼠接种对照 / ICAM-1 KO E0771，5-13 天注射 DTx;

B 图 DTx 有效清除 TdLN 中 Treg;

C 图 DTx 处理后，两组肿瘤均显著缩小，缩小程度无差异;

D 图 实验设计：左侧乳腺脂肪垫预接种 WT E0771，10 天后右侧接种对照 / ICAM-1 KO E0771;

E 图 预接种 WT E0771 可完全抑制右侧肿瘤生长，且不依赖 ICAM-1;

F 图 预接种无关 B16 黑色素瘤不抑制 E0771 生长，且该杀伤在 FcR KO 小鼠中仍存在(排除 ADCC/ADCP)。

图3：OT-I CTL 对 E0771-OVA 的杀伤不依赖 ICAM-1

A 图 FACS 证实对照 / ICAM-1 KO E0771-OVA 均表达 SIINFEKL/H-2Kb 复合物;

B 图 体外粘附实验中，ICAM-1 KO E0771 单层对 OT-I CTL 的粘附能力减弱;

C 图 体外杀伤实验中，ICAM-1 KO E0771-OVA 被 CTL 杀伤效率略低，但体内无差异;

D 图 实验设计：接种 E0771-OVA 后 3 天注射 10⁷ OT-I CTL;

E 图 体内肿瘤体积监测显示，CTL 可完全抑制两组肿瘤生长，抑制效果无差异。

图4：自发转移中 ICAM-1 不影响 E0771 播散至肺血管

A 图 实验设计：3×10⁵ RFP 标记对照 / ICAM-1 KO E0771 接种乳腺脂肪垫，14 天后检测肺内细胞;

B 图 FACS 显示，两组肺内 RFP⁺细胞数量无差异;

C-D 图 LSM 三维成像显示，两组 RFP⁺细胞在肺内分布一致，均以单个细胞为主;

E 图 空间分析证实，两组 RFP⁺细胞均主要位于 CD31⁺肺血管内。

图5：ICAM-1 抑制自发转移中 E0771 在肺内的增殖

A 图 实验设计：接种对照 / ICAM-1 KO E0771，2 周后切除原发瘤，再培养 2 周检测肺转移;

B 图 FACS 显示，对照 E0771 肺内细胞数减少 15 倍，ICAM-1 KO 细胞数增加 20 倍;

C 图 肉眼观察可见 ICAM-1 KO 组肺表面转移灶显著多于对照;

D 图 LSM 显示，对照 E0771 多为单个细胞，ICAM-1 KO 形成寡聚体及大簇;

E 图 定量显示，ICAM-1 KO 组肺内 RFP 焦点总数及大簇比例更高;

F 图 空间分析证实，ICAM-1 KO 细胞主要在肺血管内增殖形成转移灶。

图6：实验性转移中 ICAM-1 抑制 E0771 肺转移灶形成

A 图 LSM 显示，静脉注射 WT E0771 后，肺内细胞以单个形式滞留血管内;

B 图 1 小时 / 14 天后，E0771 均位于 CD31⁺血管内，不进入支气管周围血管;

C 图 实验设计：静脉注射 1×10⁴对照 / ICAM-1 KO E0771，14 天后 H&E 染色;

D 图 ICAM-1 KO 组肺转移灶数量显著多于对照;E 图 H&E 显示，ICAM-1 KO 转移灶位于肺毛细血管内。

图7：中性粒细胞通过 ICAM-1 杀伤肺内 E0771

A 图 实验设计：静脉注射对照 / ICAM-1 KO E0771 后 24 小时，过继转移 E0771 荷瘤小鼠脾脏细胞(含 TENs);

B 图 过继转移完整脾脏细胞可完全抑制对照 E0771 转移，depletion 中性粒细胞后抑制作用消失，depletion CD8⁺ T 细胞无影响;ICAM-1 KO E0771 不受脾脏细胞抑制;

C 图 体外实验中，TENs 对对照 E0771 的杀伤效率显著高于 ICAM-1 KO 细胞。

研究结论

ICAM-1 不影响乳腺癌原发灶生长：ICAM-1 敲除不改变 E0771 体外增殖、化疗敏感性及体内原发瘤生长，也不显著影响 TME 免疫细胞组成，仅轻微减少 TdLN 中 DC 与 B 细胞。

ICAM-1 与 CTL 介导的杀伤无关：无论是 Treg depletion、同源肿瘤预植入诱导的内源性 CTL 杀伤，还是 OT-I CTL 介导的特异性杀伤，均不依赖乳腺癌细胞表面 ICAM-1。

ICAM-1 通过中性粒细胞抑制肺转移：ICAM-1 不影响 E0771 播散至肺血管，但可通过结合中性粒细胞(TENs)促进肺内癌细胞杀伤，减少血管内转移灶形成;ICAM-1 敲除后，癌细胞逃避中性粒细胞杀伤，在肺血管内大量增殖。

临床意义：ICAM-1 高表达的乳腺癌患者预后更好，提示其可能作为抑制转移的保护性分子，为靶向中性粒细胞 - ICAM-1 轴干预乳腺癌肺转移提供新策略。