合成Frizzled激动剂和LRP拮抗剂在类器官培养中对Wnt/β-catenin信号通路的调控

Wnt/β-catenin信号通路在胚胎发育和组织稳态维持中发挥关键作用，通过调节干细胞自我更新和谱系分化来精确控制细胞命运。该信号通路依赖于WNT配体与Frizzled(FZD)受体和低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(LRP5/6)形成异源二聚体复合物，触发胞质中核心效应分子β-catenin的积累，随后转位至细胞核激活下游基因转录。Wnt/β-catenin信号通路的失调与多种疾病的病理过程密切相关，包括发育缺陷、癌症和退行性疾病，因此体内操控该信号通路活性为开发新的治疗策略提供了重要机遇。

在体外干细胞扩增和程序化分化领域，Wnt/β-catenin信号通路的激动剂被广泛用于维持干细胞/祖细胞的扩增，特别是在新兴的类器官技术中显示出巨大优势。然而，天然WNT配体的高疏水性和与FZD受体的交叉反应性限制了其在再生医学中的应用。现有的代理Wnt激动剂虽然能够诱导FZD-LRP异源二聚化，但表现出较弱的通路激活能力，且分子量过大，在临床转化方面面临制造挑战。此外，胞内激动剂如GSK3抑制剂CHIR存在脱靶效应风险，可能调节Wnt/β-catenin信号通路以外的多种细胞通路。因此，开发针对特定细胞表面受体的合成调节剂，既能精确调控信号级联反应，又避免穿透细胞膜，在特异性、安全性和递送方面具有显著优势。

近期，昆明医科大学类器官研究院赵冰等在Small Methods期刊上发表了题为Manipulation of Wnt/β-Catenin Signaling by Synthetic Frizzled Agonist and LRP Antagonist in Organoid Cultures and In Vivo的研究论文，该研究成功开发了两种针对Wnt/β-catenin信号通路关键受体的合成调节剂，为精确操控该重要信号通路提供了创新工具。

图示描述

1) 合成FZD激动剂RRP-pbFn的开发与优化：研究团队最初尝试开发光控sWnt系统，意外发现pMag-pbF融合蛋白具有强大的Wnt激活能力。通过系统性截短优化，确定了最佳的融合蛋白RRP-pbFn，由pMag的前120个氨基酸(RRP)与pbF的前130个氨基酸(pbFn)组成。结构分析表明，pMag中R52和R55残基对激动剂活性至关重要，突变实验证实RRP(R52I)-pbFn完全失去活性，而RRP(R55M)-pbFn活性显著降低。TOP-Flash报告基因检测显示，RRP-pbFn在HEK 293T细胞中诱导的Wnt/β-catenin信号激活强度比改进的代理Wnt(Dkk1c-pbF)高出数倍，且分子量更小，水溶性更好。

2) RRP-pbFn支持多种类器官生长和体内效应：RRP-pbFn在多种小鼠和人类类器官培养中表现出卓越的支持能力，包括小肠、肺泡、胃、肝细胞和人胆管细胞类器官。在小肠类器官中，RRP-pbFn处理使类器官变成薄壁囊状结构，表明细胞增殖增强;在其他类器官中，RRP-pbFn显著增加了类器官数量或面积。qRT-PCR分析确认RRP-pbFn上调了Wnt靶基因Lgr5和Axin2的表达。体内实验中，利用AAV-8载体表达RRP-pbFn-Fc，结合R-spondin1处理，成功调节了小鼠肝脏代谢分区，扩大了中央静脉周围谷氨酰胺合成酶阳性区域，并促进了成体肠道上皮细胞增殖，Ki67阳性细胞从隐窝扩展至绒毛底部区域。

图 1 用于高效激活 Wnt/β- 连环蛋白信号通路的合成型 Frizzled 激动剂的制备

3) RRP-pbFn独特的作用机制解析：Co-IP实验揭示RRP-pbFn与FZD5、FZD7强烈相互作用，与FZD1适度相互作用，但不直接结合LRP5/6受体，这与传统sWnt不同。功能研究表明，RRP-pbFn激活Wnt/β-catenin信号仍需要LRP5/6参与，LRP5/6的shRNA介导敲低或Dkk1c过表达均能抑制RRP-pbFn的信号激活能力。重要的是，RRP-pbFn能够诱导LRP6磷酸化，其强度甚至超过sWnt，表明RRP-pbFn通过结合FZD受体触发FZD-LRP相互作用来激活信号通路。进一步的机制研究显示，这种激活过程与电荷无关，因为RRP(R52K)-pbFn和RRP(R52H)-pbFn虽然保持与FZD7的相互作用，但失去了Wnt激活能力。

4) 合成LRP拮抗剂RRP-Dkk1c的开发与应用：基于RRP(R52I)-pbFn的拮抗特性，研究团队开发了更强效的LRP拮抗剂RRP-Dkk1c，将pbFn替换为高亲和力LRP5/6结合域Dkk1c。RRP-Dkk1c在抑制sWnt诱导的Wnt/β-catenin信号激活方面表现出优异性能，能将信号激活水平抑制至5%以下，效力显著优于Dkk1。剂量依赖性实验确认RRP-Dkk1c比Dkk1具有更强的抑制能力和更小的分子量。在类器官实验中，RRP-Dkk1c处理显著抑制了各种类器官的生长，包括小鼠小肠、胃、肺泡、肝细胞和人胆管细胞类器官，同时下调Wnt靶基因的表达。

图 2 RRP-pbFn 促进多种小鼠和人类类器官的生长

5) RRP-Dkk1c的抗肿瘤效应验证：利用CT26结肠癌细胞系建立异种移植瘤模型，评估RRP-Dkk1c的抗肿瘤潜力。稳定表达RRP-Dkk1c-Fc的CT26细胞在体外集落形成能力显著下降，经过七代传代后细胞数量仅为对照组的58%。体内实验结果更为显著，5.0×10⁵个对照细胞注射后形成肿瘤，而注射相同数量的RRP-Dkk1c-Fc稳定表达细胞的小鼠未出现任何肿瘤征象，充分证明了RRP-Dkk1c在结肠癌中的强效抗肿瘤特性。人类蛋白质图谱数据库的生存分析显示，Dkk1高表达的结肠癌患者生存率显著高于低表达患者，支持了Dkk1在Wnt/β-catenin信号抑制中的保护作用与结肠癌患者预后改善的相关性。

图 3 RRP-pbFn 通过在体内调控 Wnt/β- 连环蛋白信号通路诱导肝肠祖细胞扩增

全文总结

RRP-pbFn作为水溶性FZD激动剂，克服了天然配体的疏水性和低活性限制，在类器官扩增和Wnt依赖性再生医学发展中具有巨大应用潜力。RRP-Dkk1c作为高效LRP拮抗剂，为治疗Wnt信号异常激活的癌症提供了新的治疗策略。这些人工设计的水溶性小分子量蛋白质调节剂在推进科学研究和生物医学应用转化方面具有重要价值，同时为开发其他信号通路的关键受体调节剂提供了适用性强的研究范式。