人类诱导多能干细胞共分化和共成熟生成心肺祖细胞及微组织

从胚胎发育到成年期，心脏和肺脏始终紧密相邻，这表明两个器官之间存在器官间通讯，相互影响各自的发育程序。动物模型研究已充分证实了这一观点：来自心脏区域的Wnt配体对前肠内胚层规范至关重要，随后由特化肺内胚层分泌的Hedgehog配体对心房间隔形成起关键作用。此外，源自第二心脏区域的心肺祖细胞是肺血管形成所必需的。这些动物模型研究表明发育中的心脏和肺脏之间存在广泛的相互作用，但这些发现与人类发育的相关性仍然未知。

由于获取人类胚胎的途径有限以及伦理问题，缺乏能够将动物研究转化为理解人类发育过程中心肺相互关系的平台。诱导多能干细胞(iPSC)技术的进步已证明可以将人类iPSC直接分化为心脏或肺脏谱系，但要研究来源于中胚层的心脏和来源于内胚层的肺脏谱系在人类iPSC规范过程中的相互作用仍然具有挑战性。尽管之前的研究表明多能干细胞可以分化为中内胚层(中胚层和内胚层的前体)，最终可分别定向为心脏和肺脏谱系，但研究者探索并验证了通过调节诱导两个谱系所需的旁分泌信号，在同一培养体系中将人类iPSC分化为心脏和肺脏细胞的可能性。

现有的体外方案主要专注于将人类诱导多能干细胞分化为心脏或肺脏单一谱系，无法重现早期发育过程中心脏和肺脏之间关键信号和细胞交换。为了填补这一空白，迫切需要建立一个能够同时生成心脏和肺脏祖细胞的共分化平台，以便研究人类心肺共发育机制，为药物测试和肺组织工程中肺细胞成熟加速提供新的技术平台。

近年来，发表在Bio - protocol期刊上一篇题为Co-differentiation and Co-maturation of Human Cardio-pulmonary Progenitors and Micro-Tissues from Human Induced Pluripotent Stem Cells的研究建立了一套完整的人类iPSC心肺祖细胞共分化方案，通过时序特异性调节Wnt和Nodal信号通路实现。

该方案使用携带NKX2.1-GFP和SFTPC-TdTomato荧光报告基因的hiPSC细胞系，能够追踪早期肺祖细胞和肺泡2型细胞的出现。整个分化过程历时15天，包括原条诱导、确定性内胚层/中胚层形成、前肠内胚层/心脏中胚层规范，最终形成心脏和肺脏祖细胞。分化过程分为四个关键阶段：第0-1天使用7μM的CHIR99021激活Wnt信号;第2-3天转换为RPMI-1640基础培养基;第4-7天添加A83-01和IWP4抑制TGF-β和Wnt信号;第8-14天重新激活Wnt信号并加入视黄酸促进心肺谱系规范。

图示描述

1) 分化效率评估显示，该共分化方案能够成功生成表达心脏标志物NKX2.5和肺脏标志物NKX2.1的双重祖细胞群体。流式细胞术分析表明，第15天时NKX2.1-GFP阳性肺祖细胞的比例达到32.3%。免疫荧光染色进一步证实了NKX2.1(肺脏)和NKX2.5(心脏)标志物在分化细胞中的表达，显示出明显的空间分布模式。从第10天开始可观察到NKX2.1-GFP的出现，标志着早期肺祖细胞的形成。这些结果表明该方案能够在单一培养体系中同时诱导心脏和肺脏两个不同胚层来源的细胞谱系。

2) 通过3D悬浮培养共诱导的心脏和肺脏祖细胞，成功生成了人类心肺微组织(μTs)。第15天的心肺祖细胞经胰酶消化后重新悬浮在肺泡成熟培养基中，以50万个细胞的密度接种于超低黏附24孔板中，在125 rpm轨道摇床上培养形成微组织。培养基含有CHIR99021、KGF、地塞米松、cAMP、IBMX等关键因子。在心脏细胞存在的情况下，肺泡化过程显著加速，仅在3天内(第18天)就能检测到SFTPC-TdTomato荧光信号，表明肺泡2型细胞的快速成熟。荧光强度在第17-18天期间持续增强，证实了肺泡细胞的持续发育和成熟。

图 1 培养中的未分化诱导多能干细胞(iPSCs)

3) 最重要的发现是，在撤除外源性Wnt信号(CHIR99021)的条件下，心肺微组织能够发生自发性分离。第18天后，将单个微组织转移至96孔超低黏附板中，培养基中不再添加CHIR99021。经过5天的培养(第23天)，原本混合的心肺微组织分离为表达GFP的纯肺脏微组织和具有收缩功能的纯心脏微组织。这种分离现象表明，在没有外源Wnt信号维持的情况下，心脏和肺脏细胞会根据其内在的细胞类型特性进行自我组织和分离，形成功能性的器官特异性微组织。

4) 该研究还建立了完整的表征方法体系，包括免疫细胞化学、流式细胞术分析等。免疫染色使用NKX2.1(1:500稀释)和NKX2.5(1:500稀释)一抗，配合相应的荧光二抗进行检测。流式细胞术通过检测GFP阳性细胞比例定量分析肺祖细胞分化效率。这些方法为评估共分化效果和微组织形成提供了可靠的技术支撑，确保了实验结果的准确性和可重现性。

图 2 共诱导的人心脏 - 肺祖细胞的鉴定(表征)

全文总结

该研究建立的心肺共分化和微组织形成平台具有重要的科学价值和应用前景。首先，该技术填补了人类心肺共发育研究的空白，为理解人类胚胎发育过程中心脏和肺脏的相互作用提供了重要的体外模型。其次，该平台在药物筛选和毒性评估方面具有广阔的应用前景。传统的单一器官模型无法评估药物对心肺系统的综合效应，而该心肺共培养系统能够更好地模拟体内环境，为心肺相关疾病的药物开发提供更为准确和可靠的测试平台。特别是对于影响心肺功能的药物，该模型能够同时评估其对两个器官系统的作用效果。最后，该技术为肺组织工程和再生医学提供了新的策略。