人类肾脏祖细胞培养及其向足细胞分化的制备方法

肾脏疾病已成为全球性健康问题，其发病机制的研究和转化医学应用面临诸多挑战。这些挑战主要源于物种特异性差异以及肾脏上皮细胞(如足细胞)的有丝分裂后状态，使得原代细胞培养变得极其困难。足细胞是肾小球滤过屏障的重要组成部分，属于高度分化的有丝分裂后细胞，无法进行增殖，因此在原代培养中无法扩增，除非使用人工永生化系统。

肾单位是肾脏的功能单位，由血液过滤单元(肾小球)和相应的肾小管组成，在肾小管中通过溶质重吸收和代谢物分泌来修饰滤液，直至最终尿液通过泌尿道排出。当肾单位受到损伤时，会出现两种反应机制：一是分化的上皮细胞通过多倍体化和肥大来快速支持残余肾功能;二是未成熟的上皮细胞(称为肾脏祖细胞)通过增殖来恢复至少部分丢失的细胞，实现肾脏再生。肾脏祖细胞位于肾小球鲍曼囊内侧，并散布在肾小管的管状上皮细胞中，在人类中通过表面标志物CD133和CD24的表达来识别。这些祖细胞可以从肾组织或尿液中获得并进行长期培养，因为它们保持了自我更新的能力。肾脏祖细胞具有在体外和体内分化为多种类型肾脏上皮细胞的能力，可以扩增并分化为不同类型的肾小管上皮细胞，甚至可以进行3D培养生成肾小管样结构，这使得它们成为遗传性肾小管疾病建模的理想选择。此外，肾脏祖细胞还可以在培养中分化为足细胞，为足细胞病理学研究提供了新的途径。

近期，发表在Bio - protocol期刊上一篇题为Preparation of Human Kidney Progenitor Cultures and Their Differentiation into Podocytes的研究论文建立了一套完整的人类肾脏祖细胞分离、培养和向足细胞分化的标准化方案。研究者从肾肿瘤患者肾切除术中获得的正常肾皮质组织出发，通过酶消化和机械分离的方法成功分离出肾脏祖细胞。该方法利用肾脏祖细胞相比其他肾细胞类型约50倍的增殖能力，在特定的生长培养基中实现了纯化培养，避免了基于磁珠分离的复杂多步骤过程。

图示描述

1) 流式细胞术分析结果显示，成功建立的肾脏祖细胞培养物中CD133和CD24双阳性细胞的比例达到95%以上。这一高纯度的细胞群体在前两代培养过程中纯度逐渐提高，这是因为肾脏祖细胞生长培养基能够选择性地支持未分化肾脏祖细胞的生长。研究还建立了细胞冷冻保存和复苏的标准操作程序，确保细胞在液氮中长期保存后仍能保持良好的活性和分化潜能。

2) 在分化实验中，研究者使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂panobinostat作为分化诱导因子，成功将肾脏祖细胞诱导分化为足细胞。分化过程包括：首先将细胞置于无血清的EBM培养基中培养16小时，然后在含有0.2 μM panobinostat的DMEM-F12 + 10% HyClone定义胎牛血清的分化培养基中刺激48小时。显微镜观察显示，分化后的细胞形态发生显著变化，从原本的祖细胞形态转变为足细胞特有的复杂突起结构。

图1 实验流程示意图

3) 分子水平的检测证实了分化的成功。qRT-PCR分析显示，分化后的细胞中足细胞特异性标志物的mRNA表达水平显著上调，包括NPHS1(nephrin)、NPHS2(podocin)、KLF15(Kruppel样因子15)和SYNPO(突触调节蛋白)。这些标志物的表达增加倍数从数倍到十几倍不等，表明细胞已经获得了足细胞的分子特征。免疫荧光染色进一步确认了蛋白质水平的表达，显示分化后的细胞能够表达NPHS1和NPHS2蛋白，并呈现出足细胞特有的蛋白分布模式。

4) 超分辨率STED显微镜分析揭示了分化过程中细胞骨架的重要变化。通过α-微管蛋白和肌动蛋白的染色，研究者发现分化前的祖细胞具有相对简单的细胞骨架结构，而分化后的足细胞则表现出复杂的细胞骨架重排，形成了足细胞特有的细胞骨架组织模式。STED技术相比传统共聚焦显微镜能够以纳米级的空间分辨率识别细胞骨架的精细组织结构，为理解足细胞分化过程中的形态学变化提供了重要信息。

图 2 对源自肾脏祖细胞的足细胞的评估

全文总结

该研究建立的肾脏祖细胞培养和足细胞分化体系具有重要的科学价值和临床应用前景。首先，该方法为足细胞病理学研究提供了重要的体外模型平台。由于足细胞的有丝分裂后特性，传统的足细胞原代培养极其困难，而本研究通过祖细胞分化获得足细胞的策略有效解决了这一技术瓶颈，为足细胞疾病的机制研究和药物筛选提供了可靠的细胞模型。其次，该技术体系可以与已报告的尿液肾脏祖细胞分离方法相结合，为个体化的遗传性足细胞疾病研究提供新的途径。此外，该方法还可以结合CRISPR-Cas基因编辑技术，通过引入致病性遗传变异来构建疾病模型，为基因治疗和精准医学研究奠定基础。最后，鉴于肾脏祖细胞和足细胞在慢性肾脏病发病机制中的重要作用，该研究建立的培养和分化方法具有广泛的应用潜力。