犬诱导运动神经元方案来了！从皮肤细胞到功能神经元，助力神经疾病研究

犬作为大型动物模型在年龄相关神经退行性疾病研究中具有重要价值，但缺乏稳定的运动神经元体外模型。在此背景下，美国威斯康星大学麦迪逊分校的在《STAR Protocols》(2025, 6:103975)发表研究，建立了一套从犬皮肤成纤维细胞直接重编程为诱导运动神经元的完整方案。该方案通过慢病毒介导转录因子(Ngn2、Sox11、Isl1、Lhx3)过表达，结合小分子诱导，成功生成表达 HB9、ChAT 等标志物且具有电活性的运动神经元，为犬神经退行性疾病的分子机制研究、功能分析及药物筛选提供了可靠工具。

本研究旨在建立犬成纤维细胞直接重编程为诱导运动神经元的标准化流程。

步骤包括：

从犬皮肤活检分离并扩增原代成纤维细胞;通过慢病毒转导四环素诱导型转录因子(Ngn2、Sox11、Isl1、Lhx3)，经抗生素筛选获得 “待重编程” 细胞库;

在神经诱导培养基(含 forskolin、dorsomorphin 等)中诱导分化，最终在小鼠星形胶质细胞饲养层上长期培养;

通过免疫荧光(HB9、TUBB3、ChAT 等)和多电极阵列(MEA)验证运动神经元身份及电活性。该方案可稳定生成有功能的犬诱导运动神经元，为相关疾病研究提供模型。

研究背景

犬与人类在神经退行性疾病(如肌萎缩侧索硬化症)的病理进程上高度相似，是理想的大型动物模型，但缺乏体外运动神经元模型限制了机制研究。直接重编程技术可将成体细胞跨谱系转化为功能神经元，避免多能干细胞分化的复杂性，然而犬细胞因表观遗传障碍、转基因同源性低等问题，重编程效率远低于人和小鼠。

现有研究多聚焦于人和啮齿类，犬运动神经元模型的缺失阻碍了 translational 研究。本研究针对犬细胞特性优化重编程条件，通过转录因子组合与小分子协同作用，克服犬细胞重编程壁垒，建立首个犬诱导运动神经元生成方案，填补了该领域空白。

实验结果

图 1：犬皮肤成纤维细胞分离流程

该图展示成纤维细胞的分离步骤：从犬皮肤活检(3-6mm)中去除脂肪和毛发，经胶原酶 / DNase 消化 16-24 小时后，涡旋分离真皮与表皮，取上清接种于 T75 培养瓶。72 小时后可见贴壁的成纤维细胞(10%-30% 汇合度)，经传代纯化后，细胞呈梭形，纯度达 90% 以上。该步骤关键在于控制消化时间(16-24 小时)，避免过度消化导致细胞活力下降，且通过差速贴壁减少角质细胞污染。

图 2：直接重编程工作流程

该图展示从犬成纤维细胞到诱导运动神经元的完整时序：第 2-4 代成纤维细胞在含嘌呤霉素和杀稻瘟菌素的选择培养基中筛选，获得稳定转导转录因子的 “待重编程” 细胞库;第 5 代细胞接种后，换用含 forskolin、dorsomorphin 和多西环素的神经诱导培养基，7 天出现神经元形态，14 天通过 0.1% 明胶差速贴壁和 20μm 滤网分选纯化;16 天后接种于小鼠星形胶质细胞饲养层，用含 BDNF、GDNF 等的神经成熟培养基长期培养。整个过程历时 16 天至 12 周，最终细胞呈现典型神经元形态，证实该流程可实现成纤维细胞向运动神经元的高效转化。

图 3：犬诱导运动神经元早期标志物表达

该图通过免疫荧光验证早期分化效果：2 周时，细胞高表达运动神经元特异性转录因子 HB9 和神经元骨架蛋白 TUBB3，核染色(Hoechst 33342)显示二者共定位;定量分析 3 只不同年龄(13、15、16 岁)对照犬的细胞，HB9 阳性细胞占比均超过 50%，表明该方案在不同个体中均具有稳定的重编程效率，且早期标志物表达一致，证实细胞已启动运动神经元分化程序。

图 4：成熟犬诱导运动神经元的标志物表达

该图展示 8 周时成熟细胞的表型：免疫荧光显示细胞表达成熟神经元标志物 MAP2，同时检测到核内和胞质 ChAT(胆碱乙酰转移酶，运动神经元功能标志)及突触蛋白 Syn1，三者与核染色共定位;结果证实诱导细胞已分化为成熟的胆碱能运动神经元，具备合成神经递质和形成突触的能力，符合功能运动神经元的特征。

图 5：犬诱导运动神经元的电活性验证

该图通过多电极阵列(MEA)评估功能：12 周时，细胞仍共表达 TUBB3 和 HB9;MEA 记录到自发动作电位，波形成熟，3 只老年对照犬的细胞 firing rate 稳定;表明诱导运动神经元不仅形态和分子表型符合特征，还具备电传导功能，是有活性的功能细胞，可用于电生理相关研究。

研究结论

本研究建立了首个犬成纤维细胞直接重编程为诱导运动神经元的标准化方案：通过优化慢病毒转导(转录因子 Ngn2/Sox11/Isl1/Lhx3)、抗生素筛选和小分子诱导条件，成功生成表达 HB9、ChAT 等标志物的细胞，且在 12 周内保持电活性;该方案克服了犬细胞重编程的表观遗传障碍，可稳定应用于不同年龄个体，为犬年龄相关神经退行性疾病的机制研究、药物筛选提供了可靠模型。局限性包括成纤维细胞传代限制(约 7 代)和长期培养中细胞活力下降，未来可通过优化饲养层或培养基进一步改善。