3D 球体模型新突破！SH-SY5Y 细胞变身胆碱能神经元，助力神经毒性研究

传统神经毒性研究模型(如原代神经元、iPSC 衍生神经元)存在成本高、操作复杂等局限，而 SH-SY5Y 神经母细胞瘤细胞作为替代模型，在 2D 培养中分化能力有限。在此背景下，来自西班牙瓦伦西亚大学的团队在《Toxins》(2025, 17:336)发表研究，首次建立了 SH-SY5Y 细胞的 3D 球体模型，通过视黄酸(RA)和脑源性神经营养因子(BDNF)诱导分化为胆碱能神经元(表达 ChAT)。该模型在 22 天内保持形态稳定和活力，为农药、真菌毒素等神经毒性物质的评估提供了更接近体内环境的体外工具，兼具可重复性和 scalability。

本研究旨在开发一种 3D SH-SY5Y 球体模型，模拟胆碱能神经元用于神经毒性评估。通过优化 2D 分化方案，在超低吸附板中培养 SH-SY5Y 细胞，结合血清限制、RA 和 BDNF 诱导，构建 3D 球体;通过形态学观察、免疫荧光(ChAT、MAP2)、Western blot 及细胞周期分析验证分化效果。结果显示，该模型可稳定维持 22 天，均匀表达胆碱能标志物，为神经毒性研究提供了生理相关性更高的平台。

研究背景

神经系统的复杂性使得体外模型成为研究其功能和毒性的关键工具。原代神经元和 iPSC 衍生神经元虽生理相关性高，但成本昂贵、操作繁琐;SH-SY5Y 细胞作为永生神经母细胞瘤细胞系，易培养且可分化为神经元表型，是理想替代模型，但传统 2D 培养无法模拟体内细胞 - 细胞、细胞 - 基质相互作用。

3D 球体模型能更好地重现体内微环境，增强生理相关性。胆碱能神经元在认知功能中起关键作用，其损伤与阿尔茨海默病等相关，而现有 3D 模型中胆碱能分化的研究较少。本研究通过整合 2D 分化策略(RA 诱导、BDNF 增强)到 3D 球体培养，建立稳定表达胆碱能标志物(ChAT)的模型，填补了神经毒性评估中特异性胆碱能 3D 模型的空白。

实验结果

图 1：SH-SY5Y 球体分化方案示意图

该图展示 22 天的分化流程：第 0 天以 2000 细胞 / 孔接种于超低吸附板;第 2-6 天用含 5%-1% 血清和 10μM RA 的 DMEM/F12 预分化，每日换液;第 7-15 天换用含 10μM RA 和 5ng/mL BDNF 的 Neurobasal Plus 培养基;第 16-22 天换用含相同因子的 Neurobasal 培养基，每 3 天换液，通过血清限制和特定因子组合诱导胆碱能分化。

图 2：SH-SY5Y 球体分化与未分化状态的 22 天跟踪

该图通过光学显微镜观察显示：未分化球体在第 6 天后形态逐渐紊乱，第 10 天起球形指数(SI)低于 0.9，第 22 天完全失去圆形结构，呈现无序生长;而分化球体全程保持清晰球形，SI 稳定，至第 22 天仍维持完整形态，表明分化方案可有效控制生长，保障模型稳定性。

图 3：分化 SH-SY5Y 球体中 ChAT 和 MAP2 的表达

该图通过间接免疫荧光检测显示：分化球体中胆碱能标志物 ChAT 和神经元标志物 MAP2 均呈均匀阳性表达，而未分化球体仅在细胞密集区有微弱信号且无完整球体形态，证实分化球体成功获得胆碱能神经元表型。

图 4：细胞周期分析与 ChAT 的 Western blot 检测

该图中，流式细胞术显示分化与未分化球体在 G0/G1 期(81.7% vs 84.4%)和 S 期(4.1% vs 4.7%)细胞比例无显著差异，但分化球体 G2/M 期比例略高(10.5% vs 7.4%);Western blot 证实分化球体 ChAT 表达升高(虽无统计学显著差异)，结合免疫荧光结果，表明分化可促进 ChAT 表达，且细胞周期状态支持神经元分化特征。

研究结论

本研究成功建立了 SH-SY5Y 细胞的 3D 球体模型，通过 RA、BDNF 诱导及血清限制，在 22 天内稳定分化为胆碱能神经元(ChAT+)，且保持球形结构和活力。该模型克服了 2D 培养的生理相关性不足问题，兼具可重复性和 scalability，可用于农药、真菌毒素等神经毒性物质对胆碱能系统影响的研究，为体外神经毒性评估提供了更贴近体内环境的工具，同时有助于减少实验动物使用，符合 3R 原则。未来需进一步开展功能学研究以完善模型应用。