成纤维细胞变身“抗癌特工”，高效激活T细胞杀伤力

同源异体小鼠肿瘤模型是免疫肿瘤学(I/O)研究中不可或缺的临床前模型，但它们对免疫检查点抑制剂(ICIs)的反应有限，这可能是由于它们的固有低免疫原性。为了解决这一问题，研究人员通过将鸡卵清蛋白(OVA)这一高度免疫原性的蛋白质表达到同源异体肿瘤细胞中，开发了新的免疫原性同源异体模型。这些模型，如DC2.4-OVA和B16-OVA，显示出比它们的亲本细胞系更慢的肿瘤生长速度，这可能是由于免疫介导的排斥反应。更重要的是，这些OVA表达的模型对ICIs，特别是抗PD-1治疗，表现出更高的敏感性，这表明它们在增强T细胞介导的免疫反应方面具有潜力。此外，通过过继T细胞转移实验，研究人员验证了这些模型中存在肿瘤特异性记忆T细胞。这些结果表明，OVA工具细胞不仅增强了对ICIs的反应，而且为临床前免疫治疗评估提供了新的、具有更高免疫原性的同源异体模型，这对于I/O研究具有重要的意义。

基本信息

英文标题：Genetically engineered fibroblasts with antigen-presenting capability: Efficient induction of an antigen-specific cytotoxic T-lymphocyte response and protection against tumor development in vivo

中文标题：具备抗原呈递能力的基因工程成纤维细胞：高效诱导抗原特异性细胞毒性 T 淋巴细胞应答并在体内抑制肿瘤发展

发表期刊：《Cancer Gene Therapy》

影响因子：5

作者单位：

1.College of Pharmacy, Chonnam National University, Kwangju, Republic of Korea

2.Research Institute of Drug Development, Chonnam National University, Kwangju, Republic of Korea

3.Department of Biochemistry and Molecular Biology, Hanyang University, Kyunggi-do, Republic of Korea

4.Center for Ligand and Transcription, Chonnam National University, Kwangju, Republic of Korea

作者信息：

Tae S. Kim, Su W. Chung, Seung H. Kim, Bok Y. Kang, Seung Y. Hwang, Jae W. Lee

研究背景

肿瘤免疫治疗中，传统基因修饰肿瘤疫苗常因个体肿瘤信号缺陷受限;树突状细胞(DC)虽为高效抗原呈递细胞(APCs)，但培养和操作难度较高。成纤维细胞具有易培养、易转染、可稳定分泌细胞因子的优势，有望作为替代 APCs。本研究通过基因工程技术，使小鼠 BLK 成纤维细胞(H-2b)表达共刺激分子 B7.1 和白细胞介素 - 2(IL-2)，并脉冲卵清蛋白(OVA)的 H-2Kb 限制性表位(SIINFEKL)，验证其诱导抗原特异性细胞毒性 T 淋巴细胞(CTL)应答及体内抗肿瘤的能力，为肿瘤疫苗开发提供新策略。

研究方法

细胞与动物模型：

小鼠：7-9 周龄雌性 C57BL/6 小鼠(H-2b)，用于免疫和肿瘤挑战实验;

细胞：BLK 成纤维细胞(H-2b)、OVA 表达型 EL4 肿瘤细胞(EG7)、亲本 EL4 细胞、C1498(髓系肿瘤)、B16F1(黑色素瘤);IL-2 依赖型 CTLL-2 细胞用于检测 IL-2 活性。

基因工程成纤维细胞构建：

采用逆转录病毒载体 pZipNeoSV (X)，分别插入小鼠 IL-2 和 B7.1 cDNA，构建 pZipNeoSV-IL-2 和 pZipNeoSV-B7.1;

脂质体介导共转染 BLK 细胞，G418(500 μg/mL)筛选 14 天获得稳定克隆(BLK/IL2/B7.1);对照组为单转染(BLK/IL2、BLK/B7.1)或空载体转染(BLK/ZipNeo)细胞。

OVA 表位脉冲：

酸处理(pH 3.0 柠檬酸盐缓冲液)成纤维细胞，暴露 MHC I 类分子空位;

脉冲 H-2Kb 限制性 OVA 表位 SIINFEKL(30 μg/mL)，结合 β2 - 微球蛋白稳定 MHC - 肽复合物，构建 BLK/IL2/B7.1/OVA 细胞。

免疫与 CTL 活性检测：

免疫方案：小鼠皮下 + 腹腔注射 5×10⁶个 50 Gy 照射的基因工程细胞，2

周后取脾细胞;

CTL 活性：脾细胞与丝裂霉素 C 处理的 EG7 细胞体外重刺激 5 天(效靶比 30:1)，通过 4 小时⁵¹Cr 释放实验检测对 EG7 及其他 H-2b 肿瘤细胞的杀伤率。

细胞亚群耗竭实验：

体外：抗 CD4(GK1.5)、抗 CD8(3.155)、抗 NK1.1(PK136)抗体 + 补体耗竭脾细胞亚群，Leu-OMe 耗竭巨噬细胞，检测 CTL 活性变化;

体内：免疫前 1 周开始，每 2 天注射抗体耗竭 CD4⁺、CD8⁺或 NK1.1⁺细胞，挑战 EG7 后监测存活。

体内抗肿瘤保护实验：

免疫 2 周后，小鼠接种 1×10⁶个 EG7 细胞，记录存活时间，通过生存分析(log-rank 检验)比较各组差异。

实验结果

图1：基因工程成纤维细胞的 B7.1 表达验证

流式细胞术检测 B7.1 表达(实心峰：抗 B7.1 抗体染色;空心峰：同型对照)。结果显示，转 B7.1 的细胞(BLK/IL2/B7.1、BLK/B7.1、BLK/IL2/B7.1/OVA、BLK/B7.1/OVA)荧光强度显著高于未转染组(BLK/ZipNeo、BLK/IL2、BLK/OVA);IL-2 转染不影响 B7.1 表达水平;所有 BLK 细胞均稳定表达 H-2Kb 分子(数据未显示)。结果证实 B7.1 在基因工程细胞中成功表达。

图2：BLK/IL2/B7.1/OVA 诱导特异性 CTL 活性

A 图：不同效靶比(50:1、100:1)下，BLK/IL2/B7.1/OVA 免疫组脾细胞对 EG7 的杀伤率(45.8±3.8%，100:1)显著高于其他组(如 BLK/IL2/OVA 组 22.5±1.8%、BLK/B7.1/OVA 组 20.2±3.3%)，空载体组与未免疫组无杀伤活性(P<0.005);

B 图：该杀伤具有 OVA 特异性 —— 仅对 EG7(OVA⁺)有效，对 EL4、C1498、B16F1(均 OVA⁻)无显著杀伤(P<0.001)。结果表明 BLK/IL2/B7.1/OVA 可诱导 OVA 特异性 CTL。

图3：BLK/IL2/B7.1/OVA 延长荷瘤小鼠存活

生存曲线显示，BLK/IL2/B7.1/OVA 免疫组小鼠挑战 EG7 后，存活时间显著长于其他组(如未免疫组约 20 天，BLK/ZipNeo 组约 25 天，BLK/IL2/B7.1/OVA 组约 60 天，P<0.001);单转染组(BLK/IL2/OVA、BLK/B7.1/OVA)存活虽长于空载体组，但短于双转染组(P<0.01)。结果证实双转染成纤维细胞的体内抗肿瘤保护效果最优。

图4：体外 CTL 诱导不依赖 CD4⁺、NK1.1⁺细胞及巨噬细胞

naive 小鼠脾细胞经不同亚群耗竭后，与 BLK/IL2/B7.1/OVA 共培养 6 天，仅耗竭 CD8⁺细胞时，对 EG7 的杀伤率从 40% 降至 10% 以下(P<0.01);耗竭 CD4⁺、NK1.1⁺细胞或巨噬细胞(Leu-OMe 处理)对 CTL 活性无显著影响;与 BLK/ZipNeo 共培养或仅培养基组无 CTL 活性。结果表明，BLK/IL2/B7.1/OVA 直接诱导 CD8⁺CTL，不依赖宿主 APC、CD4⁺辅助 T 细胞及 NK 细胞。

图5：体内抗肿瘤保护依赖 CD8⁺T 细胞

A 图：体内耗竭 CD8⁺细胞后，BLK/IL2/B7.1/OVA 的免疫保护作用完全消失(存活时间降至 30 天以下，P<0.001);耗竭 CD4⁺或 NK1.1⁺细胞对存活无显著影响;B 图：体外重刺激显示，CD4⁺或 NK1.1⁺耗竭组仍保持 CTL 活性，仅 CD8⁺耗竭组活性丧失。结果进一步证实 CD8⁺T 细胞是介导抗肿瘤效应的关键细胞。

研究结论

基因工程改造的 BLK/IL2/B7.1/OVA 成纤维细胞可高效诱导 OVA 特异性 CD8⁺CTL 应答，其杀伤活性显著高于单转染(仅 IL-2 或 B7.1)或未脉冲 OVA 的细胞，且具有严格的抗原特异性。

该 CTL 诱导过程不依赖宿主自身抗原呈递细胞(APCs)、CD4⁺辅助 T 细胞及 NK1.1⁺细胞，表明工程化成纤维细胞可直接作为 APCs 启动 CTL 免疫。

体内实验中，BLK/IL2/B7.1/OVA 免疫可显著延长 EG7 荷瘤小鼠的存活时间，双转染(IL-2+B7.1)的协同效应优于单转染，证实其良好的抗肿瘤保护作用。

成纤维细胞因易培养、易基因改造的优势，有望成为肿瘤疫苗中高效的抗原呈递工具，为抗原特异性肿瘤免疫治疗提供新方向。