生物发光流感病毒：实时追踪感染的 “荧光探子” 来了！

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题：Bioluminescent reporter influenza A viruses to track viral infections

中文标题：生物发光报告基因流感 A 病毒用于追踪病毒感染

发表期刊：《bioRxiv》

影响因子：预印本

作者单位：

1. Texas Biomedical Research Institute, San Antonio, TX, USA

2. Department of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of Texas Health Sciences Center at San Antonio, San Antonio, TX, USA

3. Center of Scientific Excellence for Influenza Viruses, National Research Centre, Giza, Egypt

4. Center for Animal Health Research, CISA-INIA-CSIC, Madrid, Spain

作者信息：

Ramya S. Barre, Ahmed Mostafa, Kevin Chiem

研究背景

流感 A 病毒(IAV)可引发季节性流行和大流行，研究其感染机制需可靠的追踪工具。现有表达荧光蛋白的重组 IAV 常存在衰减现象，且不适用于活体成像(IVIS)。本研究构建了表达纳米荧光素酶(Nluc)的重组 2009 年甲型 H1N1 流感病毒(pH1N1-Nluc)，其非结构基因(NS)片段携带 Nluc，体外复制能力与野生型相当，且能在小鼠和雪貂模型中实时追踪感染，同时验证了该策略可扩展至 A/Puerto Rico/8/1934 H1N1(PR8-Nluc)，为 IAV 的体外筛选和体内动态研究提供了高效工具。

研究方法

重组病毒构建：通过反向遗传学技术，将 Nluc 序列融合至 pH1N1 和 PR8 的 NS1 蛋白 C 端，利用猪捷申病毒 - 1(PTV-1)2A 自切割序列确保 NS1 和核输出蛋白(NEP)的独立表达，构建 pH1N1-Nluc 和 PR8-Nluc。

体外表征：在 MDCK 细胞中测定病毒生长动力学、空斑形态，通过 Western blot 验证 Nluc 表达;利用 Nluc 活性检测中和抗体(KPF1)和抗病毒药物(利巴韦林)的效果。

体内实验：C57BL/6J 小鼠感染后监测体重变化、存活率及病毒滴度，通过 IVIS 追踪 Nluc 信号;雪貂模型中评估病毒复制、传播及组织 tropism，检测鼻洗液和组织中的 Nluc 活性。

稳定性测试：将 pH1N1-Nluc 在 MDCK 细胞中连续传代 10 次，通过空斑测定、NGS 验证其遗传和表型稳定性。

实验结果

图1：pH1N1-Nluc 的构建与体外表征

A-B 图展示 NS 片段改造策略(Nluc 融合于 NS1，2A 序列分离 NS1 和 NEP);

C 图显示 pH1N1-Nluc 与野生型(WT)空斑形态相似，98.11% 空斑呈 Nluc 阳性;

D 图生长动力学显示两者复制能力相当;

E-F 图证实 Nluc 在感染细胞上清和裂解物中表达，NS1-Nluc 融合蛋白分子量增加。

结果表明重组病毒保留 WT 复制特性且稳定表达 Nluc。

图2：Nluc 报告系统用于中和抗体和抗病毒筛选

A 图显示中和抗体 KPF1 对 pH1N1-Nluc 的 50% 中和效价(NT₅₀)为 3.096 ng/ml，与 WT(4.953 ng/ml)相当;

B 图利巴韦林对 pH1N1-Nluc 的 50% 抑制浓度(IC₅₀)为 1.953 μM，与 WT(2.584 μM)一致。

结果证实该系统可替代 WT 用于药物和抗体筛选。

图3：pH1N1-Nluc 在小鼠中的致病性

A-B 图显示不同剂量(10²-10⁵ PFU)感染后，pH1N1-Nluc 与 WT 引起的体重下降和存活率相似，半数致死剂量(MLD₅₀)分别为 2.89×10² 和 1.67×10² PFU。

结果表明重组病毒保留 WT 致病性。

图4-5：小鼠体内 Nluc 信号追踪

图4 显示 pH1N1-Nluc 感染小鼠的 Nluc 信号随剂量和时间增加，早期见于气管，后期扩散至肺部，WT 无信号;

图5 离体成像证实肺组织中 Nluc 信号与感染剂量正相关。结果表明 Nluc 可实时追踪病毒在体内的分布和扩散。

图6：小鼠组织中的病毒滴度与 Nluc 活性

A 图显示 pH1N1-Nluc 在鼻甲骨(NT)和肺中的滴度与 WT 相当;

B 图 Nluc 活性与病毒滴度正相关。

结果证实 Nluc 活性可反映病毒复制水平。

图7-8：雪貂模型中的复制与传播

图7 显示 pH1N1-Nluc 与 WT 在感染雪貂中体重下降和鼻洗液滴度相似，接触雪貂中可检测到病毒传播及 Nluc 信号;

图8 证实感染和接触雪貂的鼻甲骨、肺等组织中存在 Nluc 活性，且 Nluc 检测灵敏度高于病毒滴度测定。

结果表明重组病毒可用于研究传播和组织 tropism。

图9：pH1N1-Nluc 的稳定性

连续传代 10 次后，Nluc 表达稳定(P1-P10 空斑阳性率 97.56%-100%)，NGS 未检测到 NS 片段显著突变。

结果证实其遗传和表型稳定性。

图10：PR8-Nluc 的构建与表征

PR8-Nluc 与 WT 生长动力学、空斑形态相似，Nluc 活性随时间增加，Western blot 证实 NS1-Nluc 表达。

结果表明该策略可扩展至其他 H1N1 毒株。

研究结论

本研究构建的 Nluc 报告基因流感 A 病毒(pH1N1-Nluc 和 PR8-Nluc)具有与野生型相当的复制能力和致病性，可通过生物发光信号实时追踪体内外感染过程，适用于中和抗体 / 抗病毒药物筛选、病毒传播及组织 tropism 研究。其遗传稳定性高，为流感病毒的基础研究和应用开发提供了高效工具。