揭示自闭症患者脑类器官中GABA能神经元分化缺陷研究

自闭症谱系障碍(ASD)是一组以持续性社交沟通缺陷、局限性兴趣和重复行为模式为特征的神经发育障碍。虽然约15%-20%的ASD个体与环境或遗传因素相关，包括单基因疾病、拷贝数变异和染色体异常，但绝大多数病例仍为特发性，缺乏明确的可识别病因。ASD患病率的不断增加突出了识别可靠生物标志物和治疗靶点的迫切需要。

传统的动物模型虽然在很大程度上推进了我们对ASD的理解，但在复制人类特异性神经发育过程和组织结构方面存在局限性，无法完全重现独特的人类特异性ASD表型。因此，迫切需要开发基于人类的体外模型系统。患者来源的人诱导多能干细胞(hiPSC)技术引入了患者特异性疾病建模和药物筛选的新概念。然而，传统的二维(2D)分化技术通常只能产生高度均一的单一细胞类型，hiPSC来源的2D细胞类型往往缺乏准确复制人脑组织复杂性所必需的关键特征，如细胞多样性和重要的细胞间及细胞-基质相互作用。

利用人多能干细胞(hPSCs)的自组织特性，研究人员已经展示了生成微型化三维(3D)类器官的能力，这些类器官与其体内对应物具有相似的组织结构。脑类器官包含多种细胞类型，具有与发育中人脑相似的组织结构，使其成为神经发育障碍(如ASD)疾病建模和筛选潜在治疗药物的宝贵工具。之前的研究表明，来自特发性或单基因综合征ASD患者的脑类器官(COs)能够表型复制ASD患者的关键病理特征，包括改变的电生理特性、巨头畸形和兴奋性与抑制性神经元之间的失衡(E/I失衡)。

近期，苏州大学Leshuai W. Zhang/Dong Wook Han等发布在CNS neuroscience & therapeutics期刊，题为Differentiation Defect Into GABAergic Neurons in Cerebral Organoids From Autism Patients的文章旨在复制来自特发性ASD患者的脑类器官的病理表型，并为ASD治疗方法的开发进行概念验证研究。结果表明，患者来源的COs作为开发个性化药物干预治疗ASD的有价值的平台具有重要的前景。

图示描述

1) 脑类器官的成功构建与特征化。研究团队建立了从人多能干细胞生成脑类器官的分步骤方案，包括神经外胚层规范、基顶-底膜层压和成熟过程。生成的脑类器官在早期阶段(第22天)表现出几个关键特征，包括SOX2+心室区(VZ)、单层TBR1+/TUJ1+皮质板、Laminin+基底膜和Reelin+ Cajal-Retzius神经元。到第35天，观察到外室下区(oSVZ)和内室下区(iSVZ)的形成，伴随着由不同神经元层(CTIP2+深层和SATB2+表层)组成的皮质板。第45天时，脑类器官表现出明确定义的分层组织结构，包含SOX2+/PAX6+/Ki67+心室区，进一步增厚的皮质板，以及Reelin+/Laminin+边缘区，反映了妊娠中期人大脑皮质的发育状态。

图1 人类多能干细胞生成COs

2) ASD脑类器官的病理表型重现。通过分析来自特发性ASD患者的hiPSC系的脑类器官，研究发现与健康对照组相比，ASD脑类器官显示出心室区形态异常和早期神经元分化受损。具体表现为：ASD脑类器官的心室区尺寸增大且形状异常延长，这可归因于VZ中Ki67+增殖性祖细胞数量增加。在早期神经分化方面，对照组脑类器官中可以观察到TUJ1+神经元，而ASD脑类器官中即使在相同培养时间后也几乎观察不到TUJ1+细胞。RNA测序分析进一步证实了ASD脑类器官中的神经分化缺陷，对照组中高度富集的基因与神经元过程相关，而ASD组中仅有非神经元过程显著富集。

图2 特发性ASD患者及家族对照者来源的hiPSC的多能性研究

3) 药物干预对巨头畸形表型的拯救效应。为开发巨头畸形的潜在药物治疗方法，研究团队评估了各种小分子抑制剂对纠正ASD脑类器官中异常VZ结构和受损早期神经分化的效果。从第7天到第15天，当典型的巨头畸形表型变得明显时，用包括DAPT(Notch信号γ-分泌酶抑制剂)、SU5402(FGF信号抑制剂)、PD0325901(MEK/ERK通路抑制剂)和cAMP(神经分化调节剂)等小分子处理ASD脑类器官。几何分析显示，所有几何值在ASD脑类器官中都显著高于对照组，而经过每种小分子处理后，这些值都降低到与对照组相似的水平。特别是DAPT和cAMP表现出最显著的拯救效果，导致ASD脑类器官获得正常的组织结构。

图3 小分子化合物可缓解巨脑症样表型

4) GABA能神经元分化缺陷的发现。E/I失衡被认为是ASD的主要病理生理机制之一。研究通过免疫组织化学分析评估了脑类器官中GABA能和谷氨酸能神经元的分布。结果显示，表达TBR1和TBR2的谷氨酸能神经元数量在对照组和ASD组之间相似，表明谷氨酸能神经元的分化过程是可比的。然而，GABA能神经元的分化模式存在显著差异。与对照组相比，ASD脑类器官中表达GABA的GABA能神经元数量明显减少。这种偏向性分化模式导致GABA能神经元数量减少，在来自不同ASD患者的脑类器官中都能一致观察到，尽管程度有所不同。

图4 患者来源脑类器官中γ-氨基丁酸能神经元的分化缺陷

5) IGF1和加巴喷丁对GABA能神经元分化缺陷的治疗效果。基于之前的研究发现，研究团队筛选了能够拯救谷氨酸能和GABA能神经元分化失衡的GABA激动剂和其他药物，包括加巴喷丁、甘纳沙酮、维加巴汀、替加宾盐酸盐、瑞替加宾和IGF1。经过10天的药物处理(第35天至第45天)，所有药物处理都显著增加了GABA能神经元的数量。其中，IGF1和加巴喷丁表现出最显著的增加效果，表明谷氨酸能和GABA能神经元分化的失衡可以通过这两种药物有效恢复。进一步的全切片分析显示，IGF1处理的ASD脑类器官相比未处理的ASD脑类器官，谷氨酸能神经元明显减少，GABA能神经元增加，导致细胞结构更接近对照组的平衡分布。

图5 药物成功挽救了患者来源脑类器官中γ-氨基丁酸能神经元的分化缺陷

全文总结

本研究成功建立了基于特发性ASD患者脑类器官的疾病建模平台，为ASD的发病机制研究和药物开发提供了重要的工具。研究在特发性ASD患者来源的脑类器官中重现了多种ASD相关表型，包括巨头畸形样表型、早期神经分化受损和E/I失衡样表型，这些发现与近期的尸检研究结果一致，表明体外疾病建模数据可能与患者大脑中观察到的病理表型高度相关。

更重要的是，研究证明了这些病理表型可以通过小分子或药物治疗得到拯救和恢复，为ASD的早期药物干预策略发展提供了概念验证。特别是发现IGF1和加巴喷丁能够有效纠正GABA能神经元分化缺陷，为开发针对ASD的个性化药物治疗提供了新的方向。这种基于患者特异性脑类器官的药物筛选方法为识别能够改善个体ASD患者特定病理生理特征的候选药物提供了有希望的途径，有望加速ASD新型治疗方法的开发，并为将脑类器官技术转化为临床应用奠定了基础。