牛肠道研究新工具！永生化回肠上皮细胞系建立，功能与原代细胞一致

原代肠上皮细胞是研究上皮屏障功能和紧密连接蛋白的重要工具，但存在成本高、分离困难、增殖能力有限等问题。永生化细胞系可克服这些局限，却缺乏适用于牛等 livestock 研究的专用细胞系。在此背景下，来自美国 Kemin Industries 的团队在《Scientific Reports》(2025, 15:26652)发表研究，首次通过转染人端粒酶逆转录酶(hTERT)建立永生化牛回肠上皮细胞系(IBEC)。该细胞系保留原代细胞的形态和生理特性，在屏障功能实验中表现与原代细胞一致，为牛肠道健康、炎症反应及病原体相互作用的体外研究提供了稳定工具。

本研究旨在建立永生化牛肠上皮细胞系以解决原代细胞的应用局限。从 2 日龄杂交犊牛的回肠分离原代上皮细胞(PBECs)，通过转染 hTERT 实现永生化(IBEC);采用 RT-qPCR 验证细胞表型(肠上皮标志物阳性、成纤维细胞标志物阴性)，支原体检测确保无污染;通过形态观察和跨上皮电阻(TEER)实验，比较 IBEC 与 PBEC 及猪肠上皮细胞(IPEC-J2)在脂多糖(LPS)和丁酸钙处理下的屏障功能。结果显示，IBEC 形态与 PBEC 一致，表达肠上皮特异性标志物，屏障功能对刺激的响应与 PBEC 一致，为牛肠道体外模型研究提供了可靠替代工具。

研究背景

肠上皮细胞(IECs)通过紧密连接形成屏障，调控物质扩散和通透性，其功能异常与牛的肝脓肿、炎症及饲料转化率下降等密切相关。原代肠上皮细胞是研究屏障功能的理想材料，但存在分离困难、成本高、增殖能力有限且依赖活体组织等问题。永生化细胞系虽成本低、易培养且可稳定传代，却缺乏针对牛等反刍动物的专用细胞系，现有商业化细胞系多适用于人、猪等物种。

hTERT 通过维持端粒长度实现细胞永生化，已被用于建立多种动物细胞系，且能保留原代细胞的生理特性。本研究通过转染 hTERT 建立永生化牛回肠上皮细胞系，旨在填补牛肠道研究中专用细胞模型的空白，为牛肠道屏障功能、炎症反应及病原体相互作用的体外研究提供稳定工具。

实验结果

图 1：原代牛肠上皮细胞(PBECs)的分离与纯化

该图展示 PBECs 的分离过程：从 2 日龄杂交犊牛的十二指肠、空肠和回肠组织中，经胶原酶消化获得细胞，24 小时内形成小细胞簇，7 天达 70-80% 融合，可见上皮细胞与成纤维细胞混合存在(图 1B);通过 EpCAM 磁珠分选纯化后，细胞呈均一的扁平多边形，形成紧密单层，无成纤维细胞污染(图 1C)。最终选择回肠细胞进行后续实验，因其生长状态良好且回肠在小肠感染中起重要作用。

图 2：hTERT 转染实现细胞永生化(IBEC)

该图显示永生化过程的形态变化：转染前 PBECs 呈典型上皮形态(图 2A);转染后 1 天出现明显细胞死亡(图 2B);经 G418 筛选 7 天后，阳性转染细胞正常生长，形态与 PBECs 无显著差异(图 2C)。结果证实 hTERT 转染成功实现细胞永生化，且 G418 有效筛选出阳性细胞。

图 3：支原体检测结果

该图通过 3% 琼脂糖凝胶电泳验证细胞无污染：PBEC 和 IBEC 样本均未出现 464 bp 的支原体特异性条带，而阳性对照条带清晰，证实细胞未受支原体污染，确保实验可靠性。

图 4：RT-qPCR 验证细胞表型

该图通过基因表达确认细胞特性：PBEC 和 IBEC 均高表达肠上皮标志物(TMPRSS15、VIL1)、牛上皮标志物(KRT18、CDH1)，不表达成纤维细胞标志物 VIM，表明为纯上皮细胞;仅 IBEC 表达 hTERT，证实永生化成功(图 4)。Ct 值分析显示 hTERT 在 IBEC 中稳定高表达，进一步验证转染效果。

图 5：极化及 LPS 处理后的细胞形态

该图比较不同细胞的形态稳定性：经 14 天极化后，PBEC、IBEC 和 IPEC-J2 均形成完整单层(图 5A);LPS 处理 48 小时后，PBEC 和 IBEC 形态保持稳定，而 IPEC-J2 出现死亡(图 5B)。结果表明 IBEC 在炎症刺激下的形态稳定性与原代细胞一致，优于猪源细胞系。

图 6：TEER 实验评估屏障功能

该图通过跨上皮电阻检测屏障完整性：丁酸钙处理后，PBEC、IBEC 和 IPEC-J2 的 TEER 值均升高(符合丁酸钙上调紧密连接的已知作用);LPS 处理使 TEER 下降，而丁酸钙可逆转该效应(图 6A-C)。其中，IBEC 的 TEER 变化趋势与 PBEC 完全一致，证实其保留原代细胞的屏障功能特性。

研究结论

本研究成功建立永生化牛回肠上皮细胞系(IBEC)：通过转染 hTERT 实现原代细胞永生化，IBEC 表达肠上皮特异性标志物(TMPRSS15、VIL1 等)，不表达成纤维细胞标志物，无支原体污染;其形态与原代细胞(PBEC)一致，在 LPS 和丁酸钙处理下的 TEER 变化趋势相同，证实保留原代细胞的生理和屏障功能特性。该细胞系解决了原代细胞分离困难、增殖有限的问题，为牛肠道屏障功能、炎症反应、病原体相互作用等研究提供了稳定、低成本的体外模型，未来可进一步应用于肠道微生物互作、免疫应答及代谢研究。