咖喱叶提取物 Mahanine：同时抑制敏感与耐药肺癌的潜在新疗法

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具。逸漠生物自主研发了近200种表达Fluc的细胞系，均经过荧光素酶活性检测验证，可满足科研人员的多样化需求，欢迎咨询。

基本信息

英文标题：Oncogene Downregulation by Mahanine Suppresses Drug-Sensitive and Drug-Resistant Lung Cancer and Inhibits Orthotopic Tumor Progression

中文标题：Mahanine 通过下调癌基因抑制敏感及耐药肺癌并抑制原位肿瘤进展

发表期刊：《Cancers》

影响因子：4.4

作者单位：

1. Brown Cancer Center, University of Louisville, Louisville, KY 40202, USA

2. Department of Pharmacology & Toxicology, University of Louisville, Louisville, KY 40202, USA

3. Faculty of Science, Assam Down Town University, Guwahati 781026, India

作者信息：

Raghuram Kandimalla, Disha N. Moholkar, Suman Kumar Samanta

研究背景

肺癌是全球最致命的癌症之一，非小细胞肺癌(NSCLC)占 85%，化疗耐药使其治疗难度增加，5 年生存率仅 23%。癌基因(如 MET、RAS、cMyc)激活和抑癌基因失活是 NSCLC 进展的关键机制。Mahanine(MH)是咖喱叶(Murraya koenigii)中的咔唑生物碱，已被证实对淋巴瘤、乳腺癌等有抗癌活性，但其对 NSCLC(尤其是耐药株)的作用及机制尚未明确。本研究旨在探究 MH 对敏感及紫杉醇耐药 NSCLC 的抑制效果，并阐明其分子机制，为肺癌治疗提供新候选分子。

研究方法

1. MH 的分离与表征：从咖喱叶中通过乙醇提取、乙酸乙酯分相、柱层析及制备型 UPLC 纯化 MH，采用 HPLC、LC-MS(分子量 347.18)和 NMR(含 25 个 H 原子)确证纯度(>99%)。

2. 细胞培养：培养敏感株(A549、H1299、A549-Luc)和紫杉醇耐药株(A549-TR)，A549 及 A549-TR 用含 10% FBS 的 RPMI 培养基，H1299 用 DMEM 培养基，A549-Luc 添加 2μg/mL 嘌呤霉素。

3. 细胞活力与增殖检测：采用 MTT 法、发光法(A549-Luc 细胞)测定 IC50;集落形成实验评估长期增殖能力，计数 colonies 并统计抑制率。

4. 分子机制检测：Western blot 分析细胞周期(CDK4/6、CDC2)、凋亡(BCL-2、BCL-XL)及癌基因标志物(MET、p-AKT、p-mTOR、survivin、RAS、cMyc);制备核提取物检测 NF-κB，以 β-Actin 和 Lamin B1 为内参。

5. 体内实验：雌性 NOD Scid 小鼠胸腔接种 A549-Luc 细胞(1.5×10⁶)，10 天后腹腔注射 MH(25mg/kg，每周 3 次)，通过生物发光成像监测肿瘤生长，终点检测肺重量及抑瘤率。

实验结果

图1：Mahanine(MH)的分离与纯化表征

A 图 展示提取流程(乙醇浸提→乙酸乙酯分相→柱层析→制备型 UPLC);

B 图 UPLC 色谱图显示 MH 单峰;

C 图 LC-MS 证实分子量 347.18;D 图 ¹H NMR 显示 25 个 H 原子。

结果确证 MH 纯度 > 99%，结构正确。

图2：MH 对肺癌细胞增殖的抑制作用

A-C 图 MTT 法显示 MH 对 A549(IC50 7.5μM)、A549-TR(IC50 10μM)、H1299(IC50 5μM)的剂量依赖性抑制;

D-G 图 集落形成实验显示 10μM MH 显著减少 A549(48%)、A549-TR(24%)、H1299(35%)的集落数(p<0.01)。

证实 MH 对敏感及耐药株均有抗增殖活性。

图3：MH 通过抑制 CDK4/6 和 CDC2 阻滞细胞周期

A 图 示意 MH 阻滞 G0/G1 和 G2/M 期;

B-D 图 Western blot 显示 MH 剂量依赖性下调 A549、A549-TR、H1299 中 CDK4/6 和 CDC2(15μM 时抑制 50-90%，p<0.01)。

表明 MH 通过抑制细胞周期激酶阻断细胞分裂。

图4：MH 抑制抗凋亡蛋白 BCL-2 和 BCL-XL

A-C 图 显示 MH 剂量依赖性降低 A549(17.5μM 时 BCL-2 抑制 90%)、A549-TR(BCL-XL 抑制 80%)、H1299(10μM 时两者均抑制 50%)中抗凋亡蛋白表达(p<0.001)。

提示 MH 通过诱导凋亡发挥作用。

图5：MH 下调 MET/PI3K/AKT/mTOR 通路

A-C 图 显示 MH 剂量依赖性抑制 A549、A549-TR、H1299 中 MET、p-AKT、p-mTOR 及 survivin(20μM 时抑制约 70%，p<0.001)。

证实 MH 阻断 MET 下游存活通路。

图6：MH 抑制 RAS/cMyc 和核内 NF-κB

A-C 图 显示 17.5μM MH 抑制 A549、A549-TR 中 RAS 和 cMyc 达 90%，15μM 时降低核内 NF-κB>70%;H1299 中 10μM MH 即显著抑制上述分子(p<0.001)。表明 MH 靶向多个癌基因通路。

图7：MH 抑制小鼠原位肺癌生长

A 图 为实验设计(接种后 10 天给药);

B 图 显示 MH 组肺重量(214±14mg)显著低于对照组(473±93mg，p<0.01);

C-D 图 生物发光信号显示 MH 组肿瘤体积减少 70%(p<0.001)。

证实 MH 体内有效抑瘤。

研究结论

Mahanine(MH)对药物敏感(A549、H1299)和紫杉醇耐药(A549-TR)非小细胞肺癌(NSCLC)均有显著抑制作用，IC50 为 5-10μM;

其机制包括：

①阻滞细胞周期(G0/G1 和 G2/M 期)，下调 CDK4/6 和 CDC2;

②诱导凋亡，抑制抗凋亡蛋白 BCL-2、BCL-XL;

③下调 MET/PI3K/AKT/mTOR、RAS/cMyc 及核内 NF-κB 等癌基因通路。体内实验中，25mg/kg MH 可抑制小鼠原位肺癌生长达 70%(p<0.001)。

本研究揭示 MH 通过多靶点调控发挥抗 NSCLC 作用，为敏感及耐药肺癌治疗提供了新候选分子。