皮肤组织工程新突破！SA 修饰纤维蛋白水凝胶更稳定，轻松构建 3D 皮肤模型

人血浆来源的纤维蛋白水凝胶因优异的生物相容性，在皮肤组织工程中被广泛用作 3D 支架，但天然纤维蛋白水凝胶存在长期机械稳定性差、易降解收缩等局限，限制了其在复杂皮肤等效物构建中的应用。在此背景下，来自西班牙马德里卡洛斯三世大学、西班牙国家研究委员会的 团队在《Gels》(2025, 11:540)发表研究，首次通过琥珀酰亚胺基海藻酸盐(SA)化学修饰纤维蛋白水凝胶，利用 SA 的 NHS 酯基团与血浆蛋白的胺基形成稳定酰胺键，增强网络交联。结果显示，该修饰显著改善水凝胶的机械性能、降低收缩率、提高稳定性，且在 0.5-1mg/mL SA 浓度下可支持人成纤维细胞和角质形成细胞的增殖分化，成功构建具有完整真皮 - 表皮结构的 3D 皮肤模型，为皮肤组织工程提供了更优质的支架材料。

本研究旨在通过化学修饰优化人血浆纤维蛋白水凝胶的性能，以满足皮肤组织工程需求。通过 EDC/NHS 偶联反应合成琥珀酰亚胺基海藻酸盐(SA)，将其与血浆混合制备 SA 修饰的纤维蛋白水凝胶(SA - 纤维蛋白水凝胶)，探究不同 SA 浓度(0.5、1、2、3mg/mL)对水凝胶聚合动力学、微观结构、机械性能、稳定性及生物相容性的影响;通过 3D 皮肤等效物构建实验，验证其支持皮肤组织形成的能力。结果表明，SA 修饰可通过增强交联改善水凝胶性能，0.5-1mg/mL SA 的水凝胶在机械稳定性与生物相容性间达到平衡，能支持真皮 - 表皮结构形成，为皮肤组织工程提供了新型支架材料。

研究背景

纤维蛋白水凝胶因与天然细胞外基质成分相似、可促进细胞黏附增殖，被广泛用于皮肤组织工程中的 3D 支架，但其固有缺陷如培养过程中易收缩、机械强度不足、降解速度快等，限制了其在复杂皮肤模型构建和临床移植中的应用。海藻酸盐作为一种生物相容性良好的天然多糖，常被用于改性生物材料以增强其稳定性，但未修饰的海藻酸盐与纤维蛋白的相互作用较弱，难以有效改善其性能。

琥珀酰亚胺基(NHS 酯)修饰是提高多糖与蛋白质交联效率的有效手段：NHS 酯可与蛋白质的伯胺基形成稳定的酰胺键，增强材料网络结构。本研究通过 EDC/NHS 反应将海藻酸盐修饰为琥珀酰亚胺基海藻酸盐(SA)，使其能与血浆中的纤维蛋白原等蛋白质共价结合，旨在通过这种化学修饰解决天然纤维蛋白水凝胶的性能局限，同时保持其生物相容性，为构建更稳定的 3D 皮肤模型提供支撑。

实验结果

图 1：琥珀酰亚胺基海藻酸盐(SA)的合成与表征

该图通过 ¹H-NMR、FTIR-ATR 和热重分析(TGA)验证 SA 的成功合成：¹H-NMR 谱中，SA 在 2.7 和 2.8 ppm 处出现琥珀酰亚胺基的特征峰，证实 NHS 酯基团的引入;与未修饰海藻酸盐相比，SA 的 FTIR-ATR 谱在 1734、1777 cm⁻¹ 处出现 NHS 酯的羰基振动峰，1650 cm⁻¹ 处出现 N - 酰基脲的特征峰;TGA 显示 SA 在特定温度区间的重量损失与 NHS 酯和 N - 酰基脲的分解相关。通过优化反应条件(异丙醇沉淀、反应 120 分钟)，获得修饰度为 26.8% 的 SA，满足后续实验需求。

图 2：SA 修饰对纤维蛋白水凝胶聚合动力学的影响

该图通过翻转实验和紫外光谱分析水凝胶的聚合时间与透明度：翻转实验显示，对照组(0 mg/mL SA)聚合时间为 15 分钟，0.5 mg/mL SA 组聚合略快(10 分钟)，1-4 mg/mL SA 组聚合时间逐渐延长至 20 分钟，但均能完成聚合;紫外光谱显示，随 SA 浓度升高，水凝胶吸光度降低(透明度提高)，这与 SA 增强交联形成更致密均匀的网络、减少光散射有关。结果表明 SA 可适度延迟聚合但不阻碍凝胶形成，且提高水凝胶透明度。

图 3：SA 修饰对纤维蛋白水凝胶微观结构的影响

该图通过扫描电镜(SEM)观察水凝胶微观结构：对照组为典型的纤维状结构，孔隙较大;0.5 mg/mL SA 组纤维变粗、部分聚集，形成多孔结构;随 SA 浓度升高(1-3 mg/mL)，孔隙逐渐变小、结构更致密，3 mg/mL SA 组呈现高密度多孔形态。定量分析显示，孔隙尺寸随 SA 浓度升高而减小。这种结构变化与 SA 促进纤维聚集和交联增强有关，也解释了其透明度和机械性能的改善。

图 4：SA 修饰对纤维蛋白水凝胶长期稳定性的影响

该图通过重量和面积变化评估水凝胶在 PBS 中的稳定性：对照组 30 天内重量收缩 80%(前 24 小时收缩 70%)，面积收缩 45%;SA 修饰组重量收缩仅 10-25%，面积收缩约 25%，且 0.5-1 mg/mL SA 组收缩动力学相似。高浓度 SA(2-3 mg/mL)水凝胶因与玻璃容器黏附力强，难以完整剥离，提示其黏附性能可能有利于皮肤培养中的底物固定。稳定性提升源于 SA 与血浆蛋白形成的稳定酰胺键增强了网络结构。

图 5：含人成纤维细胞(hFBs)时 SA 修饰水凝胶的收缩情况

该图评估细胞存在下的水凝胶稳定性：对照组 10 天内面积收缩至初始的 25%，而 SA 修饰组(0.5-1 mg/mL)收缩较慢，10 天仍保持初始面积的 50%。可视化结果显示，1 mg/mL SA 组 10 天收缩率显著低于对照组。这表明 SA 修饰可在细胞培养条件下仍能抑制收缩，因成纤维细胞会促进基质收缩，而 SA 的交联增强可抵抗这种收缩力。

图 6：SA 修饰对纤维蛋白水凝胶流变学性能的影响

该图通过应变扫描和频率扫描分析机械性能：应变扫描显示，随 SA 浓度升高，储能模量(G')增大(表明刚性增强)，但线性黏弹性范围缩小;频率扫描显示，所有水凝胶的 G' 均高于损耗模量(G'')，且 G' 随 SA 浓度升高而增加。这表明 SA 修饰通过致密结构提高了水凝胶的弹性和机械强度，符合微观结构观察结果。

图 7：SA 修饰水凝胶的生物相容性评估

该图通过 AlamarBlue 和 Live/Dead 实验检测细胞活性：hFBs 在 0.5-1 mg/mL SA 水凝胶中增殖能力与对照组相当，2-3 mg/mL SA 组增殖受抑;HaCaT 细胞(角质形成细胞)呈现相似趋势，1 mg/mL 以上 SA 显著抑制增殖。Live/Dead 实验显示，各浓度组活细胞占比高，表明抑制作用源于增殖受限而非细胞毒性。低浓度 SA 的生物相容性良好，高浓度可能因结构过密阻碍营养交换。

图 8：SA 修饰水凝胶构建 3D 真皮 - 表皮等效物的效果

该图通过 H&E 染色和免疫荧光评估皮肤结构：0.5-1 mg/mL SA 组可形成完整的角质层、表皮和真皮结构，其中 0.5 mg/mL SA 组表皮分化良好，角质层无细胞核残留(无角化不全);1 mg/mL SA 组出现轻微角化不全。免疫荧光显示，两组均表达基底细胞标志物 K5、棘层标志物 K10 和 INV，0.5 mg/mL SA 组颗粒层标志物 LOR 表达较强，1 mg/mL SA 组 LOR 表达减弱。结果表明 0.5 mg/mL SA 水凝胶最适合构建分化完全的皮肤等效物。

研究结论

本研究通过琥珀酰亚胺基海藻酸盐(SA)修饰人血浆纤维蛋白水凝胶，成功改善了其性能：SA 的 NHS 酯基团与血浆蛋白胺基形成酰胺键，增强交联网络，使水凝胶机械强度提高、收缩率降低、稳定性增强;0.5-1 mg/mL SA 浓度在保持生物相容性的同时，可支持人成纤维细胞和角质形成细胞的增殖分化，成功构建具有完整真皮 - 表皮结构的 3D 皮肤模型，其中 0.5 mg/mL SA 效果最佳，能避免高浓度 SA 导致的表皮分化不全。该修饰策略为皮肤组织工程提供了更稳定的支架材料，有望应用于皮肤移植、药物测试等领域。