表面增强拉曼光谱技术监测人脑类器官中阿尔茨海默病生物标志物及APOE-tau轴的动态变化

阿尔茨海默病(AD)是最常见的神经退行性疾病之一，也是痴呆症的主要病因。该疾病主要以磷酸化tau(p-tau)蛋白和淀粉样β(Aβ)斑块的积累为特征。在正常生理条件下，tau蛋白是一种微管相关蛋白，具有稳定神经元结构的作用。然而，在AD患者中，tau蛋白出现过度磷酸化并形成神经纤维缠结(NFT)，这被认为是AD的主要病理特征之一。这些聚集的tau蛋白(a-tau)与NFT密切相关，导致神经元退化和突触功能障碍，最终引起认知能力下降。

载脂蛋白E(APOE)基因等位基因是与AD相关的主要遗传因素，在人类中有三种同工型：APOE2、APOE3和APOE4。其中，APOE4被认为是散发性AD最强的风险因素，占AD病例的87%。携带一个APOE4等位基因的个体患AD的风险是携带两个APOE3等位基因个体的两倍，而携带两个APOE4等位基因的个体风险增加三倍。因此，揭示APOE依赖性疾病表型对深入理解AD的病理生理学具有重要意义。

目前，tau蛋白分泌的无创监测技术，特别是跨发育阶段、年龄相关变化以及APOE与tau蛋白轴相互作用的监测仍未实现。传统的生物分子检测技术如单分子阵列(SIMOA)、介观发现(MSD)、液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)和酶联免疫吸附试验(ELISA)虽然具有高灵敏度，但受到复杂性、成本高昂、耗时等限制，且无法提供蛋白质变体或结构的详细信息。因此，需要开发一种高敏感性、无标记、非侵入性的检测平台来监测AD生物标志物的动态变化。

近期，发布在Advanced science期刊，题为Monitoring the Dynamics of Alzheimer’s Disease Biomarkers and the APOE–Tau Axis via Human Cerebral Organoids with Immuno-SERS的文章开创了一种非侵入性临床评估新方法，用于分析阿尔茨海默病的疾病状态、动态变化以及APOE与tau蛋白之间的关联。

图示描述

1) SERS基底优化与tau蛋白检测平台建立。研究团队成功制备了金包覆氧化锌(ZnO)纳米棒基底，并通过优化制备条件获得了最佳的SERS性能。通过有限差分时域(FDTD)电磁仿真验证了金纳米颗粒(GNPs)纳米标签的增强效果，结果显示GNPs纳米标签在纳米棒附近产生了额外的热点，使局域电场增强约83倍。研究建立了针对不同tau蛋白变体的特异性检测方法：300 cm⁻¹拉曼峰对应总tau蛋白(t-tau)，500 cm⁻¹峰对应聚集态tau蛋白(a-tau)，1050 cm⁻¹峰对应磷酸化tau蛋白(p-tau)。校准实验显示，纤维状tau蛋白在300 cm⁻¹处的检测限极低(7.4 fM)，足以检测人血样本中的tau蛋白水平。

图1 人脑类器官(hCOs)分泌的tau蛋白变体表面增强拉曼光谱(SERS)传感与主成分分析(PCA)方案

2) 人脑类器官发育阶段的SERS识别。通过主成分分析(PCA)对SERS光谱进行降维处理，成功识别出hCOs的四个不同发育阶段：胚胎体(EB)、神经元分化、神经元成熟和维持阶段。PCA结果显示，三个主成分解释了96.2%的方差比，轮廓系数为0.41，表明聚类质量良好。PCA载荷值突出了对这种区分贡献最大的光谱区域，特别是300、700和1050 cm⁻¹处的峰，这些峰分别对应t-tau、蛋白质中的C-S拉伸振动和磷酸化。这些结果表明tau蛋白分泌特征与hCOs发育阶段之间存在强烈相关性，证明了SERS-based生物标志物分析在快速有效区分hCOs生物状态方面的多功能性。

图2 基于SERS谱的不同hCOs分化阶段PCA分析

3) tau蛋白分泌的时间动态监测。研究对APOE3/E4 hCOs从第40天(神经元成熟完成前)到第123天(维持阶段)进行了时间序列监测。结果显示，从第40天到第74天，所有tau变体(t-tau、a-tau、p-tau)的含量都增加，这与神经元成熟基本完成的时间点(约第70天)相符。有趣的是，第74天后所有tau蛋白变体水平开始轻微下降，到第123天时呈现显著下降。免疫组化染色验证显示，p-tau表达的逐渐增加趋势与SERS数据中的时间依赖性观察结果相似。星形胶质细胞计数数据显示，星形胶质细胞在第71天开始出现，在第111天急剧增加，这与SERS数据中观察到的tau蛋白变体轻微减少时间点一致，支持了星形胶质细胞摄取和清除tau蛋白的假设。

图3通过SERS和IHC验证对hCOs分泌的tau蛋白进行时间监测

4) RNA测序分析揭示APOE-tau轴。利用两个公开的转录组数据集进行基因本体(GO)和蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)分析，发现脑类器官和脑组织的转录组数据都与tau和p-tau相关术语(微管结合、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、体树突室等)以及突触功能高度相关。PPI分析确定了与APOE-tau轴直接相关的基因：在类器官中发现6个基因，在人脑中发现13个基因直接与负责tau表达的MAPT基因相关。这些转录组数据强烈支持了对APOE-tau直接轴的研究需求，为利用iPSC驱动的hCOs结合CRISPR-Cas9介导的APOE基因编辑和SERS技术研究APOE与tau形式之间的直接相关性提供了理论依据。

图4 对脑类器官(APOE3/E3 vs E4/E4)和人脑(E4非携带者vs E4携带者)进行转录组学分析，以揭示可能的APOE-tau轴基因

5) APOE基因型依赖的tau蛋白分泌模式。研究比较了不同APOE基因型(APOE2/E2、E3/E3、E4/E4)的hCOs在未成熟(第40天)和成熟(第100天)状态下的tau蛋白分泌。在未成熟状态下，APOE3/E3 hCOs分泌的tau蛋白含量最高，但PCA结果显示没有明确的基因型依赖聚类(轮廓系数0.24)，表明遗传风险在未成熟状态下没有明确表现。相比之下，成熟的hCOs表现出一致的、统计学显著的tau蛋白分泌单调递增模式，随着遗传风险的增加从APOE2/E2到APOE4/E4逐渐增加。APOE4/E4同源hCOs表现出最高水平的t-tau、a-tau和p-tau分泌，而APOE2/E2同源hCOs显示最低的蛋白质分泌水平。PCA结果显示明确的基因型依赖聚类(轮廓系数0.67)，两个主成分解释了96.79%的方差，突出了与APOE4/E4相关的遗传风险对成熟状态hCOs的显著影响。

图5 人类皮质类器官(hCOs)在不同培养天数(第40天和第100天)及载脂蛋白E基因型(APOE2/E2、E3/E3和E4/E4)条件下分泌的tau蛋白表面增强拉曼光谱(SERS)检测结果

全文总结

本研究建立了一种基于SERS的高灵敏度、非侵入性、无标记平台，用于检测来自hCOs的tau蛋白变体这一关键AD生物标志物，证明了所提出的体外方法在AD研究中的可行性。该技术平台成功监测了APOE同源hCOs在未成熟和成熟状态下基因型依赖的生物标志物分泌，揭示了随着遗传风险从APOE2/E2增加到APOE4/E4，tau蛋白分泌逐渐增加的规律。这种无标记、非侵入性的生物标志物检测方法为AD的早期诊断、疾病进展监测和药物筛选提供了新的技术手段，有望促进新型诊断平台的开发并增强神经退行性疾病的药物筛选过程。该研究为临床评估疾病状况、动态变化以及AD中APOE与tau关系提供了直接洞察，为APOE-tau轴的深入研究奠定了坚实基础。