类器官药物筛选罕见癌症治疗药物

小细胞卵巢癌-高钙血症型(Small cell carcinoma of the ovary, hypercalcemic type, SCCOHT)是一种极为罕见且致命的青少年和年轻成人女性肿瘤。文献中仅报道了约500例SCCOHT病例。对于这类罕见癌症，改善治疗方案面临诸多挑战，包括开展临床试验的困难以及缺乏可用的模型来研究肿瘤生物学。目前，SCCOHT患者尚无标准治疗方案。没有有效的治疗指南，SCCOHT患者的总体生存率仅为10%-20%，而国际妇产科联盟(FIGO)IV期SCCOHT患者的生存预期不到一年。手术、化疗、放疗及其组合在迄今最大的SCCOHT回顾性队列研究(n=293)中均显示临床效果不佳。

SCCOHT通过SMARCA4和/或SMARCA2免疫染色缺失进行诊断。先前研究表明，超过95%的SCCOHT携带SMARCA4基因的体细胞和/或生殖细胞突变，该基因编码SWI/SNF染色质重塑复合物的一个组分。SCCOHT中的SMARCA4改变涉及截断性突变(移码和无义突变)。SCCOHT具有非常低的遗传复杂性，迄今尚未发现其他复发性突变，表明SCCOHT是一种单基因疾病，仅由SMARCA4双等位基因功能丧失突变驱动。

类器官模型是三维干细胞衍生培养物，可长期生长并捕获其来源组织的关键生物学特征。该技术的关键是使用细胞外基质样水凝胶(即基底膜提取物/Matrigel)结合针对特定组织量身定制的生长因子混合物。随着类器官技术的最新进展，肿瘤样类器官(从肿瘤组织生成的类器官)可以在体外培养多种癌症和肉瘤。多项研究表明，肿瘤样类器官可以指导针对个体肿瘤类型和患者的治疗策略，包括(罕见的)儿科癌症。

近日，研究团队在Science Advances发表题为Organoid drug profiling identifies methotrexate as a therapy for SCCOHT, a rare pediatric cancer的研究文章。研究旨在开发培养SCCOHT肿瘤样类器官的方案，并使用这些类器官进行化合物筛选，为这种基本无法治疗的癌症类型确定治疗策略。

研究结果

1，SCCOHT患者来源类器官的建立

研究团队从三位青少年SCCOHT患者(年龄16-18岁)的原发性肿瘤组织(卵巢)和转移性肿瘤组织(乙状结肠直肠、子宫、膀胱、网膜等)中建立了八条患者来源的肿瘤样类器官系。使用含有进阶DMEM/F12、不含维生素A的B27、N2、表皮生长因子(EGF)、FGF2、胰岛素样生长因子1(IGF-1)和0.5%基底膜提取物的培养基，成功率达到88.8%(9个培养中的8个)。所有肿瘤样类器官系在类器官培养基中至少可传代15次。一旦建立，大多数肿瘤样类器官可在没有EGF、FGF2或IGF-1的情况下传代，而PS-02b和PS-02c的肿瘤细胞生长仍依赖于EGF或FGF2。苏木精-伊红染色和SMARCA4免疫组织化学显示，肿瘤样类器官保留了相应患者肿瘤的细胞形态，并确认了SMARCA4蛋白表达的缺失。

2，SCCOHT类器官重现了SCCOHT肿瘤的遗传特征

全基因组测序(WGS)显示，患者来源的肿瘤样类器官保留了匹配肿瘤的遗传特征。三位患者的肿瘤均携带SMARCA4杂合生殖系突变和SMARCA4杂合体细胞突变。研究中未发现三位SCCOHT患者的其他复发性体细胞突变。值得注意的是，肿瘤样类器官和相应患者肿瘤共享体细胞改变，强调了它们的遗传相似性。从SCCOHT肿瘤和肿瘤样类器官的WGS数据中提取的突变签名分析检测到三种突变签名(SBS31、SBS107和SBS167)。其中，SBS31是一种与铂类药物治疗相关的签名，仅在接受铂类治疗后采集的样本中检测到;SBS107在所有样本中富集;而SBS167在同一患者的不同病灶部位表现出异质性，体现了肿瘤样类器官捕获了肿瘤间异质性的能力。

图1 中通量药物筛选鉴定出甲氨蝶呤是一种选择性的小分子抑制剂

3，SCCOHT类器官重现了SCCOHT肿瘤的转录组特征

RNA测序分析确认，在PMC队列中，肿瘤样类器官与SCCOHT肿瘤的相似度高于其他儿科肿瘤类型。与其他儿科肿瘤组织相比，SCCOHT肿瘤组织和肿瘤样类器官中的SMARCA4和SMARCA2 mRNA表达水平显著降低(P值<0.0001)。基因集富集分析(GSEA)表明，先前报道的SMARCA4靶基因在SCCOHT肿瘤组织和肿瘤样类器官中的表达显著低于其他儿科肿瘤组织。进一步验证时，研究人员纳入了Curie队列和Gustave Roussy队列的RNA-seq数据集，包含SCCOHT(n=11)、SMARCB1缺陷性非典型畸胎/横纹肌样肿瘤(ATRT;n=38)、SMARCB1缺陷性颅外横纹肌样肿瘤(ECRT-SMARCB1;n=19)和SMARCA4缺陷性颅外横纹肌样肿瘤(ECRT-SMARCA4;n=4)。UMAP分析显示，SCCOHT肿瘤样类器官与SCCOHT肿瘤分组在一起，并且与各种其他肿瘤类型分开，包括SWI/SNF缺陷性横纹肌样肿瘤。

4，甲氨蝶呤是针对SCCOHT的有效选择性小分子生长抑制剂

研究团队使用SCCOHT肿瘤样类器官来识别有效且选择性的小分子化合物。对八条SCCOHT肿瘤样类器官进行了包含153种临床可用细胞毒性和靶向药物的中通量药物筛选(5天药物暴露)，并将SCCOHT肿瘤样类器官的药物反应与其他25种儿科或青少年和年轻成人癌症肿瘤样类器官进行比较。多重t检验分析确定了甲氨蝶呤(一种靶向二氢叶酸还原酶、亚甲基四氢叶酸还原酶、5-氨基咪唑-4-羧酰胺核糖核苷酸转甲酰酶/IMP环水解酶和胸苷酸合成酶的细胞毒性药物)是SCCOHT肿瘤样类器官的最佳选择(校正P值=0.000296)。与目前在临床试验中的药物(tazemetostat和palbociclib)、传统用于治疗SCCOHT的药物以及最近显示临床前有效性的药物相比，甲氨蝶呤对SCCOHT肿瘤样类器官的效果更好。验证筛选确认了甲氨蝶呤对SCCOHT肿瘤样类器官的高效力，IC50值在20-62 nM之间，比甲氨蝶呤治疗患者的最大血浆浓度低21-68倍。在2周期间测试时，甲氨蝶呤有效抑制了肿瘤细胞生长，证明了长期疗效。

图2 甲氨蝶呤激活TP53通路，诱导类器官细胞周期停滞和细胞凋亡

5，甲氨蝶呤激活SCCOHT肿瘤样类器官中的P53通路

为了研究甲氨蝶呤对SCCOHT肿瘤样类器官的作用，研究人员对代表性SCCOHT肿瘤样类器官进行了甲氨蝶呤处理前后的RNA-seq。差异基因表达分析显示，甲氨蝶呤处理后1072个基因上调，205个基因下调。GSEA分析表明，甲氨蝶呤处理诱导P53通路和凋亡的激活，以及细胞周期相关通路的下调。甲氨蝶呤处理显著增加了抑制细胞周期进展(CDKN1A和BTG2)或促凋亡的P53转录靶标的表达。研究结果表明，临床相关剂量的甲氨蝶呤可能通过P53通路激活在SCCOHT肿瘤样类器官中引起细胞周期阻滞和凋亡。进一步研究发现，叶酸和四氢叶酸的添加显著增加了甲氨蝶呤的IC50值，而甲基供体和腺苷受体拮抗剂对甲氨蝶呤疗效没有影响。此外，嘌呤衍生物次黄嘌呤，而非嘧啶脱氧核苷酸胸苷，减弱了甲氨蝶呤的效果，暗示甲氨蝶呤通过叶酸途径抑制SCCOHT中的嘌呤产生。

全文总结

本研究成功建立了SCCOHT肿瘤样类器官，这些类器官捕获了肿瘤异质性和患者治疗历史。在多样化遗传和转录组背景的肿瘤样类器官中进行的药物筛选有助于为这类极度罕见且致命的癌症类型设计治疗策略。研究团队计划在临床上测试基于甲氨蝶呤的治疗方案，尽管有案例报告描述甲氨蝶呤在不同年龄、肿瘤分期和治疗历史的三例患者中临床疗效有限。单药甲氨蝶呤治疗的有效性需要在更大的类器官队列中进行测试，特别是从年轻成人或低分期SCCOHT患者中生成的类器官。总之，这项研究不仅展示了类器官技术在罕见癌症研究中的应用价值，也为SCCOHT这种目前缺乏有效治疗手段的罕见肿瘤提供了潜在的治疗方向。