开发人类黏膜黑色素瘤类器官平台：建模肿瘤异质性和探索免疫治疗联合策略

黏膜黑色素瘤(MM)是一种侵袭性强且罕见的黑色素瘤亚型，在东亚人群中比高加索人群更为常见，其特点区别于皮肤黑色素瘤，预后较差。MM通常起源于黏膜膜的黑色素细胞，大约40%的病例发生在口腔。MM与皮肤黑色素瘤(CM)相比，具有更差的预后、未知的病因和不同的基因变异特征。MM的5年生存率仅约20%。此外，与CM相比，MM展示了低点突变负荷但高结构变异数量，包括癌基因(如AGAP2、CDK4、MDM2和TERT)的扩增。CM中常见的突变基因如BRAF、NRAS和NF1在MM中较少见，而c-KIT和POM121的体细胞突变在MM中相对较为频繁。

目前，术后MM转移尚无专门批准的治疗方法。对MM的医疗建议主要基于CM的治疗方法，但报告的益处有限。例如，通过阻断程序性细胞死亡蛋白1/程序性死亡配体1通路(抗PD-1/PD-L1)的免疫检查点阻断治疗已被推荐用于晚期CM。相比之下，这种治疗对MM的效果较差(总体反应率：CM为40.9%;MM为20.3%)，这可能是由于MM中CDK4通路组分的基因改变、PD-L1较低的表达和失衡的微生态所致。因此，迫切需要为MM患者找到新的治疗方法或涉及抗PD-1/PD-L1的治疗组合。然而，缺乏MM特异性的公共数据库和细胞模型阻碍了潜在临床选择的开发和验证。大多数可用的黑色素瘤细胞模型是CM细胞系，考虑到CM和MM之间已知的差异，这些模型不能准确代表MM的遗传学、生物学表型或药物反应。因此，建立忠实反映亲本肿瘤特征的MM特异性细胞模型至关重要。

上海交通大学孙舒扬团队在Science Advances发表题为A human mucosal melanoma organoid platform for modeling tumor heterogeneity and exploring immunotherapy combination options的文章，研究团队开发了人类黏膜黑色素瘤类器官，来作为探索肿瘤进化和免疫治疗联合策略的模型。

研究结果

1，研究团队成功建立了30个来自21位患者的口腔黏膜黑色素瘤(OMM)类器官，年龄范围从28岁到73岁。这些类器官保留了亲本肿瘤的主要组织病理学和功能特征。在这些类器官中，20%源自淋巴转移，而其余80%源自原位肿瘤。此外，12个类器官来自药物治疗后的组织，18个来自治疗前组织。由于OMM进展迅速，研究团队能够在2至6个月内从同一患者的不同时期获取样本，并生成代表每位患者两种疾病进展状态的六组类器官，为研究肿瘤进化和比较药物反应提供了宝贵资源。此外，还从每个大型肿瘤病变内的两个不同区域生成了三组类器官，便于探索肿瘤内异质性。

图1 建立患者来源的口腔黏膜黑色素瘤类器官

2，这些类器官在明场图像中呈现完全黑色外观，并在生长速率和形态上展示多样性。根据类器官边缘的可观察特征，研究团队将其分为两类：一类呈现上皮样球形结构，边缘较平滑("上皮样");另一类呈现侵袭性、松散的结构，有类似神经元树突的分支从细胞体延伸("侵袭样")。这些形态学差异支持了OMM的多态性。苏木精-伊红染色显示了OMM类器官与亲本肿瘤之间强烈的组织病理学特征一致性，包括具有胞质内黑素分布的细胞学多态性。类器官也表达黑色素瘤标记物(S100、SOX10、MELANA和GP100)、黑色素体标记物(TYRP1和LAMP2)和增殖标记物(Ki67和p-mTOR)。

3，为评估类器官中的体细胞突变和DNA拷贝数变异，研究者进行了全外显子测序。线性回归分析显示，OMM类器官保留了至少60%在亲本肿瘤中检测到的变异，显著高于不匹配对的比率。在OMM与对应类器官之间的成对比较中，基因组范围内的拷贝数变异(CNV)显示了强烈一致性。OMM类器官保留了各种染色体变化，包括5p15(TERT)、7q11(POM121)、7q34(BRAF)和12q13-15(CDK4和MDM2)染色体区域的增益，以及9p21(CDKN2A/B)和17q15(TP53)染色体区域的缺失。这些结果支持了OMM类器官与亲本肿瘤的整体遗传学代表性。

4，通过对OMM类器官进行的药物筛选，发现多靶点受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂安罗替尼(正在OMM治疗的二期临床试验中测试)以及索拉非尼和瑞格非尼对类器官有相对敏感性。此外，两种常用于化疗的紫杉烷类药物多西他赛和紫杉醇也对类器官有效。OMM类器官内组织异质性，包括不同的基因组改变和表达谱，显示出对药物的异质性反应。例如，与OMM3_OLN相比，OMM3_OS富集TNFα和KRAS信号通路，这与其对干扰素-γ(一种免疫相关蛋白)和曲美替尼(MAPK抑制剂)的敏感性相关。

5，研究还建立了OMM类器官与自体免疫细胞的共培养系统，以研究OMM对抗PD-1治疗的反应及探索克服细胞耐药性的治疗组合。通过转录组分析发现，抗PD-1耐药的OMM中受体酪氨酸激酶(RTK)信号通路，特别是神经生长因子受体(NGFR)显著上调。在类器官-免疫细胞共培养系统中，将抗PD-1与安罗替尼(多靶点RTK抑制剂)或NGFR敲低结合，显著增强了免疫细胞在抗PD-1耐药组中的有效活性。此外，一项回顾性观察研究显示，接受抗PD-1与安罗替尼联合治疗的OMM患者，其总体生存期较仅接受抗PD-1治疗的患者更长(中位生存时间：90周对34周)。

全文总结

本研究成功建立了捕捉OMM肿瘤内和肿瘤间异质性的30个类器官模型。这些类器官在组织病理学特征和分子特性方面与亲本肿瘤和人类OMM整体高度一致。缺乏针对罕见黑色素瘤形式(如OMM)的特定批准疗法，突显了这些类器官模型对快速建模、药物筛选和早期和晚期病变的临床前测试的效用。研究通过对OMM类器官进行药物筛选，确定安罗替尼(多靶点RTK抑制剂)作为OMM的有希望的治疗选择。

此外，涉及OMM类器官和自体CD8+ T细胞或外周血单个核细胞的共培养系统证明，OMM类器官中的安罗替尼治疗或NGFR敲低显著增强了接受纳武利尤单抗治疗的抗PD-1耐药组中免疫细胞的有效活性。这一发现为理解OMM对免疫治疗的抵抗机制提供了新的见解，并支持将RTK抑制与PD-1抑制结合作为潜在治疗策略的有效性。

总之，研究团队为OMM生成的类器官模型库是研究这种罕见黑色素瘤形式的宝贵资源。这些类器官展示了与CM相比不同的基因组景观和表达谱。利用这些类器官，研究者能够深入了解OMM发病机制，开发和预测潜在的临床方法，并为未来的个性化医疗奠定基础。这项研究突显了基于类器官的方法在OMM研究中的强大力量和未来潜力，为推进对这种具有挑战性疾病的理解和治疗提供了可能性。