溶菌酶衍生肽在小鼠空肠类器官中诱导GLP-1分泌并调节大鼠血糖的研究

肠道上皮是肠道环境与食物之间的界面，协调消化和营养吸收过程。肠内分泌细胞虽然仅占细胞组成的1%，但能够作为真正的营养传感器，响应食物摄入释放各种激素。膳食蛋白质摄入是诱导这些激素分泌的有效刺激物，包括胰高血糖素样肽-1(GLP-1)。GLP-1是一种肠促胰岛素，负责控制食物摄入和葡萄糖稳态，包括血糖水平调节。

先前研究表明，不同食物蛋白质、蛋白质水解产物和游离氨基酸能够在人体研究中诱导GLP-1释放。乳清蛋白水解产物的十二指肠内输注可触发GLP-1释放并降低瘦体型和肥胖受试者的葡萄糖浓度。多项研究表明，肽段，特别是寡肽，而非小肽或游离氨基酸，是主要的GLP-1诱导剂。已有研究证实来自牛血红蛋白、鸡蛋清、罗非鱼和β-酪蛋白的少数肽序列能够刺激GLP-1释放。

然而，诱导GLP-1分泌所需的肽结构特征尚未完全明确。先前对STC-1细胞中牛奶和鸡蛋清蛋白肽的筛选发现，来自鸡蛋清溶菌酶的三个序列，包括¹²³WIRGCRL¹²⁹肽，是STC-1细胞系中GLP-1分泌的有效诱导剂。虽然肠内分泌细胞系如STC-1、GLUTag或NCI-H716是研究肠道激素分泌及相关机制的宝贵体外模型，但这些细胞系存在一定局限性，特别是STC-1细胞表达较低水平的肽转运蛋白1(PEPT-1)和一些钾离子通道亚基。因此，肠道类器官作为一种更具生理相关性的方法应运而生，它们是干细胞衍生的3D培养模型，能够模拟小肠的表型结构、细胞组成和部分功能。

近期，发布在Journal of agricultural and food chemistry期刊，题为A Lysozyme- Derived Peptide Induces GLP-1 Secretion in Mouse Jejunal Organoids and Modulates Glycemia in Rats的文章目的是研究一种溶菌酶衍生的肽诱导GLP-1在小鼠空肠类器官中的分泌，这种肽以前被认为是一种有效的促分泌素STC-1细胞。为探究序列需求，研究人员通过将每个氨基酸替换为丙氨酸构建了一个肽库。在STC-1细胞和空肠类器官中，探究了溶菌酶衍生肽产生GLP-1促分泌作用的相关通路，并通过Wistar大鼠口服葡萄糖耐量试验评估了该序列调节血糖水平的能力。

研究结果

1，GLP-1分泌动力学分析

研究评估了溶菌酶衍生肽¹²³WIRGCRL¹²⁹在空肠类器官中1小时内诱导的激素表达和GLP-1释放，以鸡蛋清消化物(EWD)和苯丙氨酸(Phe)作为复合(全消化物)和简单阳性对照。结果显示，虽然苯丙氨酸在10分钟时诱导更快的GLP-1反应，但¹²³WIRGCRL¹²⁹肽在较低浓度(20倍)下引起了相似的GLP-1反应。在类器官中，肽在60分钟时引起的GLP-1释放为57.8±5 pM，而苯丙氨酸达到43.7±1 pM。相对前胰高血糖素基因表达支持了¹²³WIRGCRL¹²⁹肽在60分钟时的增强效应，达到2.4倍变化。在STC-1细胞中，该肽诱导了667.7±24.2 pM的GLP-1，而苯丙氨酸诱导416.6±40.1 pM。

图1 暴露于EWD、123WIRGCRL129(肽)或小鼠肠道类器官中的Phe后10、30和60分钟GLP-1的释放

2，序列需求分析

为了全面分析¹²³WIRGCRL¹²⁹发挥GLP-1分泌促进效应的序列需求，研究合成了基于母肽的肽库，通过将每个氨基酸替换为丙氨酸进行测试。结果表明，将¹²³W、¹²⁶G和¹²⁹L替换为丙氨酸可增加GLP-1水平，而其他替换不会改变诱导GLP-1释放的能力。重要的是，所有序列都具有高疏水性(高于16.75)，这与先前描述的疏水性评分在13-27之间的肽具有强烈GLP-1分泌效应一致。HPLC-MS/MS分析显示，在所有情况下，最丰富的肽对应于检测形式，但上清液中较短序列的存在突出了类器官中蛋白水解酶的作用。

3，信号通路机制研究

为了研究类器官中GLP-1分泌涉及的通路，进行了针对IRS1、AMPK和ERK磷酸化的免疫印迹研究。结果显示，在EWD孵育后，p-ERK在样品暴露后15和30分钟时过表达约2倍，这种磷酸化可能与GLP-1释放相关。在STC-1细胞系中进行相同实验时，观察到EWD在所有时间点诱导p-ERK过表达和p-AMPK下调表达。该肽在5和15分钟时诱导ERK磷酸化增加，在60分钟时p-AMPK下调表达，即GLP-1水平显著高于对照的时间点。这些结果表明ERK和AMPK介导的通路参与了该肽诱导的GLP-1分泌。

图2 在STC-1细胞中添加肽段123WIRGCRL129(1 mM)或EWD(2 mg/mL)或缓冲液后的5、15、30和60分钟，检测了p-IRS1、IRS1、p-AMPK、AMPK、p-ERK、ERK、GAPDH和HSP90的表达情况

4，体内血糖调节效应

基于类器官中获得的GLP-1结果以及¹²³WIRGCRL¹²⁹对模拟胃肠道消化的存活能力，在Wistar大鼠中进行了口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。将¹²³WIRGCRL¹²⁹肽对血糖水平的影响与形成该肽的氨基酸等摩尔混合物进行比较。接受肽处理的组将葡萄糖水平维持在基础水平直至15分钟，而在氨基酸混合物处理的大鼠中，葡萄糖水平如接受葡萄糖超负荷的对照组一样增加。结果证明了肽序列延迟最大葡萄糖峰30分钟的能力，并将这一效应专门归因于肽序列而非单个氨基酸。

图3 在给予3毫克/千克葡萄糖负荷前45分钟及给药后15、30、60和120分钟时的血糖水平(单位：毫克/分升)

5，血浆肠促胰岛素水平测定

在口服葡萄糖挑战后15分钟测量了肠促胰岛素血浆水平。肽序列或氨基酸混合物处理均未相对于葡萄糖超负荷对照组增加血浆GIP水平。然而，用肽序列预处理的大鼠中发现显著更高的GLP-1水平。这表明观察到的肽组中葡萄糖水平最大峰的延迟可能是由于其GLP-1诱导作用，这与¹²³WIRGCRL¹²⁹序列在STC-1细胞和小鼠空肠类器官中的潜在GLP-1分泌效应一致。研究证实了该肽在更复杂的生理环境中保持其生物活性，为其潜在的临床应用提供了重要证据。

全文总结

本研究在小鼠空肠类器官中证实了来源于鸡蛋清溶菌酶的肽¹²³WIRGCRL¹²⁹能够有效诱导GLP-1分泌，并在大鼠体内试验中展现出调节血糖的能力。这一发现对于开发基于食物肽的2型糖尿病治疗策略具有重要意义。类器官模型作为更接近生理条件的研究平台，为深入理解肠道激素分泌机制提供了新的视角。研究揭示的ERK和AMPK信号通路参与机制，为进一步优化肽序列设计和作用机制研究奠定了理论基础。此外，该研究强调了食物源性生物活性肽在营养干预和功能食品开发中的应用潜力，为利用天然食物成分防治代谢性疾病提供了科学依据。