mRNA 技术新突破：转染牛细胞表达抗毛滴虫抗体，为牛病防治开辟新路径 图片

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题：Transfection of bovine cells with synthetic mRNA to induce expression of functional antibodies against Tritrichomonas foetus surface antigen TF1.17

中文标题：利用合成 mRNA 转染牛细胞诱导抗牛毛滴虫表面抗原 TF1.17 的功能性抗体表达

发表期刊：《Experimental Parasitology》

影响因子：1.6

作者单位：

1. Department of Pathobiology and Population Medicine, College of Veterinary Medicine, Mississippi State University, Mississippi State, MS, USA

2. Wallace H Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, Atlanta, GA, USA

3. Department of Animal and Dairy Science, College of Agriculture and Life Sciences, Mississippi State University, Mississippi State, MS, USA

作者信息：

Merrilee Thoresen, Daryll Vanover, E. Heath King, Darcie Sidelinger, Jean M. Feugang, Hannah E. Peck, Kenzie McAtee, Philip J. Santangelo, Amelia R. Woolums

研究背景

牛毛滴虫(Tritrichomonas foetus)是引起牛泌尿生殖系统感染的性传播寄生虫，可导致母牛流产和公牛无症状携带，造成严重经济损失。目前美国尚无获批治疗药物，仅能通过淘汰病牛控制疫情，局限性显著。牛毛滴虫表面抗原 TF1.17 是关键黏附因子，针对其的抗体可抑制寄生虫黏附和存活。本研究通过合成 mRNA 转染牛细胞，诱导抗 TF1.17 抗体表达，评估其结合寄生虫、降低活力及减轻细胞病变的能力，为开发牛毛滴虫病的 mRNA 疗法奠定基础。

研究方法

1. 合成 mRNA 设计与制备：基于抗 TF1.17 的鼠源单克隆抗体序列，替换为牛 IgG1 恒定区，构建编码抗 TF1.15 和 TF1.17 表位的 mRNA(含分泌型和糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定型两种形式)，并在轻链融合 NanoLuc 报告基因，通过体外转录合成 mRNA。

2. 细胞转染与抗体表达检测：转染牛肾细胞(BK)和原代包皮角质形成细胞(PK)，24/48 小时后通过发光法检测细胞裂解物和上清中的抗体表达(通过 NanoLuc 发光信号量化)，免疫荧光实验(IFA)验证抗体定位;通过磷脂酶 C(PLC) cleavage 回收锚定型抗体，ELISA 测定浓度。

3. 抗体结合与功能检测：将转染后 24/48 小时的上清与牛毛滴虫共孵育，通过发光法和 IVIS 成像验证抗体结合;用浓缩抗体处理寄生虫，CellTox Green 试剂检测活力变化;将寄生虫与转染细胞共培养，中性红染色评估抗体对细胞病变的保护作用。

4. 统计分析：采用单因素方差分析(ANOVA)和 Kruskal-Wallis 检验，以 p<0.05 为差异显著标准。

实验结果

图1：合成 mRNA 编码的抗体结构示意图

展示抗 TF1.15 和 TF1.17 表位的抗体结构，包括分泌型(SEC)和 GPI 锚定型(ANC)重链(含牛 IgG1 恒定区)，轻链融合 NanoLuc 报告基因，均含多聚 A 尾。结果明确了 mRNA 的设计框架，为抗体表达奠定基础。

图2：实验设计流程图

A 图为细胞转染及抗体表达检测流程;B 图为锚定型抗体回收及功能实验设计;C 图为抗体对寄生虫细胞病变的保护作用评估流程。清晰呈现了实验逻辑，确保步骤可重复。

图3-4：转染细胞中抗体的表达量

图.3 显示 24/48 小时细胞裂解物中，锚定型抗体表达量显著高于分泌型，BK 细胞中抗 TF1.15 锚定型抗体 24 小时表达量最高;

图.4 显示上清中抗体表达量为对照组的 5000-25000 倍，BK 细胞分泌型抗体 24 小时表达量显著较高。证实转染细胞可高效表达功能性抗体。

图5：免疫荧光验证抗体表达

IFA 显示转染的 PK 和 BK 细胞中，锚定型抗体定位于细胞膜，分泌型抗体分布于细胞内外，对照组无信号。直观证实抗体的正确表达与定位。

图6-7：抗体与牛毛滴虫的结合

图6 显示转染上清处理的寄生虫发光信号为对照组的 100-25000 倍;

图7 IVIS 成像证实抗体结合，锚定型抗体信号更强且随时间增强。表明抗体可特异性结合寄生虫表面抗原。

图8：抗体对寄生虫活力的影响

抗 TF1.17 抗体处理组寄生虫死亡荧光信号(RFU)为抗 TF1.15 组的 2 倍，显著高于对照组。证实抗体可降低寄生虫活力，且抗 TF1.17 效果更显著。

图9：抗体对细胞病变的保护作用

共培养 24 小时后，表达抗 TF1.17 抗体的 BK 细胞存活率(51%/43%)显著高于对照组(31%)。表明抗体可减轻寄生虫对宿主细胞的损伤。

研究结论

本研究首次通过合成 mRNA 转染牛细胞(BK 和 PK)，成功诱导抗牛毛滴虫表面抗原 TF1.17 的功能性抗体表达，包括分泌型和锚定型两种形式。这些抗体可特异性结合寄生虫，显著降低其活力(抗 TF1.17 效果更优)，并在共培养 24 小时后减轻对宿主细胞的病变作用。该成果为开发 mRNA 介导的牛毛滴虫病防治新方法提供了实验依据，有望突破现有仅依赖淘汰病牛的局限性。