WTAP介导的m6A修饰稳定PDIA3P1，促进食管鳞状细胞癌中组蛋白乳酸化驱动的肿瘤进展

基本信息

英文标题：WTAP Mediated m6A Modification Stabilizes PDIA3P1 and Promotes Tumor Progression Driven by Histone Lactylation in Esophageal Squamous Cell Carcinoma

中文标题：WTAP介导的m6A修饰稳定PDIA3P1，促进食管鳞状细胞癌中组蛋白乳酸化驱动的肿瘤进展

发表期刊：《Advanced Science》

影响因子：14.3

作者单位：皖南医学院第一附属医院胸外科、南京医科大学附属无锡人民医院、安徽省非编码RNA基础与临床转化重点实验室

作者信息：

Tao Huang, Qi You, Jiawei Liu, Xuguang Shen, Dengjun Huang, Xinlu Tao, Zhijie He,Chengwei Wu, Xinran Xi, Shouqiang Yu, Feng Liu, Zhihao Wu,* Wenjun Mao,*and Shaojin Zhu*

研究背景

1.食管鳞癌(ESCC)的现状与挑战

ESCC是常见的消化道恶性肿瘤，预后差，5年生存率仅20%。

长链非编码RNA(lncRNA)在肿瘤进展中发挥重要作用，但PDIA3P1的具体机制尚不明确。

2.代谢重编程与表观调控

肿瘤细胞依赖有氧糖酵解(Warburg效应)产生大量乳酸，乳酸化修饰(如组蛋白乳酸化)与肿瘤发生密切相关。

m6A RNA修饰通过调控lncRNA稳定性参与肿瘤进展。

3.研究创新点

首次揭示PDIA3P1通过糖酵解-乳酸-H4K8la-BMP7轴促进ESCC进展。

阐明WTAP介导的m6A修饰通过IGF2BP1依赖的途径稳定PDIA3P1的分子机制。

研究方法

1. PDIA3P1的功能验证

通过shRNA和过表达构建稳定细胞系，验证PDIA3P1对糖酵解(2-NBDG摄取、乳酸生成)和肿瘤行为(增殖、凋亡、迁移)的影响。

2. 机制解析

ceRNA机制：PDIA3P1作为miR-152-3p的海绵，上调GLUT1表达。

蛋白互作：PDIA3P1与HK2结合，阻断MARCH8介导的HK2泛素化降解。

表观调控：乳酸诱导H4K8la修饰，激活BMP7转录。

m6A修饰：WTAP介导PDIA3P1的m6A甲基化，IGF2BP1增强其稳定性。

3. 实验技术

RNA-seq、CUT&Tag(H4K8la全基因组定位)、MeRIP-qPCR(m6A检测)、Co-IP(蛋白互作验证)、体内外肿瘤模型

实验结果

图1：PDIA3P1在食管鳞状细胞癌中作为糖酵解促进因子

(A) 通过RNA测序分析shPDIA3P1与shNC对照组差异基因的KEGG代谢通路。

(B、C) 采用流式细胞术检测转染PDIA3P1-siRNA (B)或PDIA3P1表达质粒(C)细胞的2-NBDG摄取量(MFI：平均荧光强度)。

(C、E) 沉默PDIA3P1 (D)或过表达PDIA3P1(E)细胞的乳酸生成量。

(F、G) 敲低PDIA3P1(F)或过表达PDIA3P1(G)细胞的葡萄糖摄取检测。

(G、I) PDIA3P1敲低(H)或过表达(I)细胞的ECAR(乙酰辅酶A生成速率)、糖酵解质子外排率(glycoPER)、基础糖酵解和代偿性糖酵解的Seahorse代谢分析(Rot/AA：鱼藤酮/抗霉素A;2-DG：2-脱氧-D-葡萄糖)。

(J、K) 沉默PDIA3P1(J)或过表达PDIA3P1(K)细胞的乙酰辅酶A相对水平。

(K、M) 敲低(L)或过表达(M)PDIA3P1细胞的𝛼-酮戊二酸相对含量检测。数据为三次重复实验的平均值±标准差。ns：无显著差异;**P<0.01;***P<0.001。

图2：糖酵解介导PDIA3P1调控食管鳞状细胞癌进展

(A) 糖酵解示意图及抑制靶点。

(B-G) 用外源性乳酸(15mm)处理TE-1和Eca-109细胞24小时后，PDIA3P1的稳定沉默效果。

(B) 通过CCK-8检测法评估增殖能力。

(C) 使用集落形成实验分析ESCC细胞生长，上图为统计分析结果。

(D) EdU染色评估ESCC细胞增殖能力，上图为统计分析结果。比例尺：100 μm。

(E) 通过流式细胞术检测TE-1和Eca-109细胞凋亡的Annexin V-APC/7-AAD染色，右图为统计分析结果。

(F) 使用Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭能力，上图为统计分析结果。Transwell比例尺：10 μm。

(G) 蛋白印迹显示E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、波形蛋白和Snail的表达水平，数据为三次重复实验的平均值±标准差。*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。

图3：PDIA3P1通过上调GLUT1和HK2促进食管鳞癌细胞糖酵解

(A、B) 西部印迹分析显示，PDIA3P1在TE-1和Eca-109细胞中稳定沉默后(A)，或在KYSE-30和KYSE-150细胞中稳定过表达后(B)的GLUT1、HK2、PFKFB3、PKM2及LDHA表达水平。

(B、E、G、I) 在PDIA3P1稳定敲低的Eca-109细胞中，分别转染GLUT1和HK2过表达质粒。

(C、F、H、J) 在PDIA3P1稳定过表达的KYSE-150细胞中，分别转染GLUT1 siRNA和HK2 siRNA。C、D)通过流式细胞术检测相对2-NBDG摄取量(MFI：平均荧光强度)。

(D、F) 使用乳酸检测试剂盒测定相对乳酸生成量。

(H、H) 检测食管鳞癌细胞的相对葡萄糖摄取量。

(I、J)经Seahorse代谢分析仪检测包括ECAR、glycoPER、基础糖酵解速率和代偿性糖酵解速率在内的糖酵解速率。数据以三次重复实验的均值±标准差表示。*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。

图4：PDIA3P1通过海绵效应调控miR-152-3p来调节GLUT1表达

(A、B) qRT-PCR检测稳定PDIA3P1敲低细胞(A)和稳定PDIA3P1过表达细胞(B)中GLUT1 mRNA水平。

(B) 通过AGO2的RIP实验检测AGO2免疫沉淀沉淀物中的内源性PDIA3P1水平。

(C) 借助miRNet和ENCORI预测PDIA3P1海绵作用的miRNA，以及通过miRNet、TargetScan、miRDB和ENCORI预测的靶向GLUT1的miRNA，交集预测出五个miRNA。

(E、F) AGO2-RIP实验显示PDIA3P1敲低细胞(E)或PDIA3P1过表达细胞(F)中预测的五个miRNA富集情况。G)PDIA3P1与miR-152-3p的潜在结合序列。

(H) TE-1和Eca-109细胞共转染野生型或突变型lncRNA PDIA3P1及miR-152-3p模拟物或对照组，通过双荧光素酶报告基因检测。

(I) 含WT或MUT PDIA3P1转录本的荧光素酶报告基因与miR-152-3p抑制剂或miR对照共转染KYSE-30和KYSE-150细胞。

(J) FISH结果显示PDIA3P1与miR-152-3p在Eca-109细胞胞质中的共定位。

(K) 通过生物素-miR-152-3p或生物素-miR对照富集PDIA3P1。

(L) miR-152-3p在GLUT1 3′-UTR区域的潜在结合序列。

(M) ESCC细胞共转染野生型或突变型GLUT1 3′-UTR及miR-135b-3p模拟物或对照组，通过双荧光素酶报告基因检测。

(N) 含WT或MUT GLUT1 3′-UTR的荧光素酶报告基因与miR-152-3p抑制剂或miR对照共转染ESC癌细胞。O)将miR-152-3p抑制剂转染至稳定PDIA3P1敲低细胞后，通过qRT-PCR检测GLUT1表达水平。P)将miR-152-3p模拟物转染至稳定PDIA3P1过表达细胞后，通过qRT-PCR检测GLUT1表达水平。

(Q、R) 将miR-152-3p抑制剂转染至稳定PDIA3P1敲低细胞(Q)或miR-152-3p模拟物转染至稳定PDIA3P1过表达细胞(R)后，通过Western blot检测GLUT1表达水平。数据以三次重复实验的平均值±标准差表示。*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。

图5：PDIA3P1通过MARCH8介导的泛素-蛋白酶体通路抑制HK2降解

(A、B) qRT-PCR检测PDIA3P1敲低细胞(A)和PDIA3P1过表达细胞(B)中HK2 mRNA水平。

(D) 使用CHX(200 μg/mL)对PDIA3P1敲低细胞进行Western blot分析，检测HK2蛋白稳定性。

(E) PDIA3P1敲低细胞经MG132(10 μM)或CQ(20 μM)处理后HK2表达量的Western blot分析。

(F) 稳定沉默PDIA3P1的细胞中HK2泛素化水平的Western blot检测，IgG作为阴性对照。

(G) 使用Flag抗体对PDIA3P1敲低细胞进行免疫共沉淀，并检测免疫复合物中K48连接泛素和K63连接泛素的表达。

(H) PDIA3P1下拉实验结合Western blot验证其与HK2的相互作用。

(I) 将Flag-HK2质粒转染至KYSE-150和Eca-109细胞后，使用HK2抗体进行RIP实验。(I) FISH和IF分析显示PDIA3P1与HK2在胞质中共定位。

(J) 分别敲低SYVN1、MARCH1、MARCH8、MDM2和CBL-b后，通过Western blot检测HK2表达。

(K) 通过Co-IP实验验证胃癌细胞中SYVN1或MARCH8与HK2的相互作用。

(L) IF分析显示MARCH8与HK2在胞质中共定位。

(M)将Flag-HK2质粒转染至PDIA3P1敲低细胞后，使用抗Flag抗体进行Co-IP检测MARCH8与HK2的相互作用。

(N)将MARCH8 cDNA质粒转染至PDIA3P1-OE细胞，并通过Western blot检测HK2表达。数据为三次重复实验的平均值±标准差。ns：无显著性差异;***P<0.001。

图6：PDIA3P1通过促进糖酵解途径上调H4K8la水平

(A) 蛋白质印迹显示正常细胞系HEEC与五种食管鳞癌细胞系(KYSE-30、KYSE-150、KYSE-520、TE-1和Eca-109)中Pan Kla的表达水平。

(B、C) 蛋白质印迹分析显示PDIA3P1稳定沉默后TE-1和Eca-109细胞(B)以及PDIA3P1稳定过表达后KYSE-30和KYSE-150细胞(C)中Pan Kla的表达变化。

(C、E) 免疫荧光染色代表性图像显示PDIA3P1敲低(Eca-109，D)或PDIA3P1过表达(KYSE-150，E)对Pan Kla表达的影响。

(F、G) PDIA3P1敲低(F)或PDIA3P1过表达(G)细胞中组蛋白特异性乳酸化位点的蛋白质印迹分析。

(G、I) 免疫荧光染色代表性图像显示PDIA3P1敲低(Eca-109，H)或PDIA3P1过表达(KYSE-150，I)对H4K8la表达的影响。

(J) PDIA3P1敲低细胞经乳酸处理24小时后，通过蛋白质印迹检测H4K8乳酸化水平。

(K) PDIA3P1过表达细胞在2-DG或草酰乙酸培养基中培养24小时后，通过蛋白质印迹检测H4K18la水平。

图7：BMP7是ESC细胞中H4K8乳酸化作用的靶标

(A) 通过deepTools可视化H4K8la结合密度：热图展示了shNC和shPDIA3P1细胞中不同H4K8la富集峰的CUT&Tag标签计数。

(B) H4K8la位点相对于翻译起始位点(TSS)的分布情况。

(C) shPDIA3P细胞中下调的H4K8la结合峰全基因组分布。

(D) 候选靶基因中H4K8la结合峰减少的KEGG分析。

(E) 对照组和shPDIA3P1细胞的转录组测序结果。

(F) 通过Venn图整合CUT&Tag、RNAseq、GEO和pubmed数据库，识别H4K8la潜在下游靶标。G)整合基因组浏览器追踪显示BMP7启动子区域H4K8la富集的CUT&Tag轨迹，红色矩形框标注靶基因启动子上的H4K8la峰区。

(H-K) PDIA3P1-KD细胞(H、J)和PDIA3P1-OE细胞(I、K)中BMP7 mRNA及蛋白水平检测。L)PDIA3P1-KD细胞在乳酸培养24小时后BMP7表达的Western blot分析。M)PDIA3P1-OE细胞在2-DG或草酰乙酸培养24小时后BMP7表达的Western blot分析。

(N、O) 使用H4K8la抗体进行CUT&Tag-qPCR分析，检测PDIA3P1-KD细胞(N)和PDIA3P1-OE细胞(O)BMP7启动子结合状态。数据为三次重复实验的平均值±标准差。**P<0.01;***P<0.001。

图8：PDIA3P1通过BMP7在体外和体内促进食管鳞状细胞癌的肿瘤发生

(A) Western blot检测BMP7表达水平，反映慢病毒转染BMP7的效果。

(C-G) 使用慢病毒构建TE-1和Eca-109细胞系中BMP7稳定过表达，同时稳定敲低PDIA3P1。B)通过CCK8法检测细胞增殖能力。

(B) 采用集落形成实验评估TE-1和Eca-109细胞的肿瘤生长情况。

(C) 使用EdU法检测食管鳞状细胞癌细胞的增殖能力。EdU标尺：100 μm。

(D) 流式细胞术显示Annexin V-APC和7-AAD染色的细胞凋亡情况。

(E) 通过transwell实验评估迁移和侵袭能力。transwell标尺：10 μm。G) Western blot显示E-Cadherin、N-Cadherin、波形蛋白、Snail和BMP7的表达水平。

(H-K) 将转染对照组、shPDIA3P1或shPDIA3P1与BMP7的Eca-109细胞皮下注射建立裸鼠肿瘤模型(n = 6)。H)各组肿瘤大小的照片及对比。

(I) 每5天测量并记录皮下肿瘤参数，根据以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积= 0.5×长度×宽度×宽度(mm³)。

(J) 各组肿瘤重量。

(K) 裸鼠肿瘤组织代表性免疫组化显示Ki-67和BMP7表达。标尺：20 μm。TUNEL免疫荧光染色显示皮下肿瘤组织切片。标尺：50 μm。这些数据代表三次重复实验的平均值±标准差。*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。

图9：IGF2BP1通过识别WTAP介导的m6A修饰增强PDIA3P1稳定性

(A) SRAMP预测的PDIA3P1特异性m6A峰富集分布。

(B) 正常细胞系HEEC与五种食管鳞癌细胞系(KYSE-30、KYSE-150、KYSE-520、TE-1和Eca-109)中PDIA3P1的m6A修饰水平MeRIP-qPCR分析。

(C) WTAP与PDIA3P1表达呈正相关的相关性分析。

(D) TE-1和Eca-109细胞中WTAP敲低后PDIA3P1表达的qRT-PCR分析。

(E) TE-1和Eca-109细胞共转染pmirGLO-PDIA3P1荧光素酶报告载体与WTAP siRNA后的相对荧光素酶活性。

(F) 经放线菌素D(10 μg mL−1)处理不同时间点的WTAP沉默细胞，通过qRT-PCR检测PDIA3P1水平。

(G) 通过MeRIP-qPCR检测WTAP沉默细胞中PDIA3P1的m6A修饰水平。

(G) PDIA3P1的下拉实验结合Western blot验证其与WTAP的相互作用。

(H) 使用WTAP抗体在KYSE-150和Eca-109细胞中进行RIP实验。

(I) 在TE-1和Eca-109细胞中转染WTAP siRNA后，野生型及其突变体pmirGLO-PDIA3P1报告载体的相对荧光素酶活性(WT：野生型;A-G突变：腺嘌呤残基被鸟嘌呤取代;A-T突变：腺嘌呤残基被胸腺嘧啶取代;A-Del突变：腺嘌呤残基缺失)。

(K) 在食管鳞癌细胞中进行IGF2BP1沉默时，野生型及其突变体pmirGLO-PDIA3P1报告载体的相对荧光素酶活性。

(L) 通过qRT-PCR检测对照组和IGF2BP1沉默细胞中PDIA3P1的稳定性。

(M) 通过PDIA3P1下拉实验结合Western blot验证其与IGF2BP1的相互作用。

(N) 使用IGF2BP1抗体进行RIP实验。

(O) FISH与IF双染色显示PDIA3P1与IGF2BP1在细胞质中的共定位。

(P) 在共转染WTAP过表达载体和IGF2BP1 siRNA的KYSE-30和KYSE-150细胞中，通过qRT-PCR分析PDIA3P1表达水平。

(Q) 共转染WTAP过表达载体和IGF2BP1 siRNA的KYSE-30和KYSE-150细胞中相对荧光素酶活性检测。

(R) 在共转染WTAP过表达载体和IGF2BP2 siRNA的食管鳞癌细胞中，通过qRT-PCR检测PDIA3P1稳定性。

(S) 分别转染OCT4 cDNA或WTAP cDNA后，通过qRT-PCR检测PDIA3P1表达水平。数据为三次重复实验的平均值±标准差。ns：无显著差异;*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。

图10：研究示意图

研究结论

PDIA3P1促进糖酵解：敲低PDIA3P1抑制GLUT1/HK2表达，降低乳酸生成;过表达则相反。

H4K8la激活BMP7转录：PDIA3P1通过增加H4K8la修饰富集于BMP7启动子区，促进其表达。

m6A修饰调控PDIA3P1稳定性：WTAP介导PDIA3P1的m6A修饰，IGF2BP1识别后延长其半衰期。

体内外功能验证：BMP7过表达可逆转PDIA3P1敲低对肿瘤生长的抑制。

科学意义：

揭示了lncRNA、代谢重编程、组蛋白修饰和RNA修饰的交叉调控网络。

提出PDIA3P1作为ESCC治疗的潜在靶点。

转化价值：

为靶向糖酵解或乳酸化修饰的抗肿瘤策略提供理论依据。