HBV 如何加剧肝纤维化和肝癌？研究揭示 JNK 介导的自噬是关键

乙肝病毒(HBV)感染是全球主要公共卫生问题之一，有超过2.5亿人慢性感染HBV。而其中有超三分之一的人口集中在我国，人数接近1亿人。NTCP工具细胞，特别是外源表达NTCP的肝癌细胞系如HepG2-NTCP和Huh7-NTCP，因其易操作、短周期、重现性佳的特点，在乙肝病毒(HBV)研究中扮演着至关重要的角色。这些细胞模型能够有效模拟HBV的感染过程，为研究HBV的生命周期、宿主限制因子、病毒复制以及药物筛选提供了一个强大而便捷的体外平台。它们不仅有助于揭示HBV感染的分子机制，如DDX3作为宿主限制因子阻碍cccDNA转录，GPC5作为附着因子在感染入胞过程中的作用，还能通过直接与NTCP相互作用或下调NTCP表达来筛选和验证抗病毒药物的活性，例如环孢菌素A及其衍生物、雷帕霉素及其衍生物等。此外，这些工具细胞还促进了对HBV宿主特异性分子的发现，为发展支持HBV感染的小动物模型提供了可能，这对于乙肝相关研究和药物开发具有重大意义。

基本信息

英文标题：HBV promotes epithelial-mesenchymal transition in HCC and liver fibrosis through JNK-mediated autophagy

中文标题：HBV 通过 JNK 介导的自噬促进肝癌上皮间质转化和肝纤维化

发表期刊：《Hepatology Communications》

影响因子：4.6

作者单位：

1. Center of Hepato-Pancreato-Biliary Surgery, The First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou, Guangdong Province, China

2. Liver Center and Gastrointestinal Division, Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, USA

3. Department of Pathophysiology, School of Medicine, Jinan University, Guangzhou, Guangdong Province, China

4. Department of Infectious Diseases, The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei, Anhui Province, China

5. Department of Infectious Diseases, Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang, Liaoning Province, China

作者信息：

Dong Chen, Jian Hong, Wenting Li, Qiuju Sheng, Olivia Mezzetti, Min Xu, Shadi Salloum, Raymond T. Chung, Wenyu Lin

研究背景

乙型肝炎病毒(HBV)是导致肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌(HCC)的主要原因，但 HBV 感染如何通过自噬和上皮间质转化(EMT)促进肝病进展的机制尚不明确。自噬参与肝纤维化和 HCC 发生，EMT 则与癌细胞转移和肝纤维化相关，但 HBV 感染、自噬与 EMT 之间的关联尚未阐明。本研究旨在探索 HBV 是否通过 JNK 介导的自噬调控 EMT 和肝纤维化，为 HBV 相关肝病的治疗提供潜在靶点。

研究方法

1. 细胞模型与培养：使用 HBV 复制模型(HepAD38 细胞，tet 调控 HBV 表达)、HBV 感染模型(Huh7.5.1-NTCP 细胞，过表达 HBV 受体 NTCP)及原代人肝细胞(PHHs)，验证 HBV 对自噬、EMT 和纤维化的影响。

2. 分子调控实验：通过 siRNA 沉默自噬相关基因(ATG5、ATG7)、JNK 及 TGF-β1，或过表达 HBV 亚基因组(X、C 等)，探究对自噬、EMT 和纤维化的影响;通过质粒转染构建 NTCP 过表达细胞模型，用于 HBV 感染实验。

3. 病毒制备与感染：从 HepAD38 细胞上清获取 HBV 病毒，经沉淀纯化后感染 NTCP-Huh7.5.1 细胞或 PHHs，检测感染效率。

4. 功能与分子检测：采用免疫荧光检测 LC3(自噬标志物)和波形蛋白(EMT 标志物)的定位与表达;Transwell 实验检测细胞侵袭能力;划痕实验评估细胞迁移;qPCR 检测相关基因 mRNA 水平;Western blot 分析蛋白表达(如 LC3-I/II 转化、E - 钙粘蛋白、α-SMA 等);通过 Cell TiterGlo 检测细胞活力。

5. 统计分析：使用 SPSS 软件，采用 t 检验或 Mann-Whitney u 检验分析数据，以 p<0.05 为差异显著，实验至少重复 3 次。

实验结果

图1：HBV 复制促进 HepAD38 细胞的自噬、肝纤维化和 EMT

通过 HepG2 与 HepAD38 细胞对比，显示 HBV 复制(A 图 HBV DNA 升高)可上调自噬相关基因(ATG5、ATG7 等，B、C 图)和蛋白(LC3-I 向 LC3-II 转化，D 图)，促进 EMT(波形蛋白升高、E - 钙粘蛋白降低，E、G 图)及纤维化相关基因 / 蛋白(α-SMA、TIMP1 等，F、G 图)表达，并增强细胞侵袭能力(H 图)。结果证实 HBV 复制可诱导自噬、EMT 和肝纤维化。

图2：HBV 感染促进 Huh7.5.1-NTCP 细胞的自噬、肝纤维化和 EMT

HBV 感染 NTCP 过表达的 Huh7.5.1 细胞后，HBV DNA 水平升高(A 图)，自噬相关基因 / 蛋白表达增加(B-D 图)，EMT(E、G 图)和纤维化标志物(F、G 图)上调，细胞侵袭能力增强(H 图)，与 HepAD38 细胞结果一致，证实 HBV 感染的类似作用。

图3：HBV 诱导的 EMT、肝纤维化和 HCC 侵袭依赖自噬

siRNA 沉默 ATG5 或 ATG7 后，自噬相关基因(A 图)和 LC3 puncta(B 图)减少，纤维化标志物(α-SMA、TIMP1，C 图)和 EMT 标志物(波形蛋白降低、E - 钙粘蛋白升高，D、F 图)受抑，细胞侵袭能力下降(H 图)。结果表明 HBV 的上述作用依赖自噬。

图4：HBV-X 和 HBV-C 参与诱导自噬 / EMT / 纤维化

转染 HBV-X、HBV-C 或全长 HBV 后，自噬相关基因 / 蛋白(LC3 升高、SQSTM1 降低，A、B、F 图)、EMT 标志物(波形蛋白升高、E - 钙粘蛋白降低，C、E 图)及纤维化基因(D 图)表达增加，细胞迁移能力增强(G 图)。证实 HBV-X 和 HBV-C 是关键调控因子。

图5：TGF-β1 促进 HBV 诱导的自噬 / 纤维化 / EMT

TGF-β1 处理可增加 GFP-LC3 puncta(A 图)、LC3-II 转化及波形蛋白表达(B 图)，增强 HBV 诱导的细胞侵袭(C 图)和纤维化标志物(α-SMA、TIMP1，D 图)表达，且与 HBV-X 或 HBV 感染协同促进波形蛋白表达(E 图)。提示 TGF-β1 部分参与该过程。

图6：JNK 与 TGF-β1 相互作用调控 HBV 诱导的自噬

沉默 TGF-β1 可抑制 EMT 和纤维化(A-C 图)，但对自噬标志物无显著影响(D-F 图);

沉默 TGF-β1 下调 JNK1 表达(G 图)，而沉默 ATG5/ATG7 可降低 JNK1 表达(H 图)。

表明 TGF-β1 部分参与，JNK 可能是更关键的调控因子。

图7：JNK 在 HBV 诱导自噬 / EMT / 纤维化中起关键作用

沉默 JNK 可抑制 HBV 诱导的自噬、EMT 和纤维化标志物表达(A-C 图);

HBV-X/C 过表达或感染可上调 TGF-β1 和 JNK1(D-F 图);

过表达 ATG5/ATG7 可促进 HBV 诱导的 JNK 磷酸化及纤维化 / EMT 蛋白表达(G、H 图)。

证实 JNK 通过磷酸化介导自噬，进而促进下游过程。

图8：JNK 在 PHHs 中调控 HBV 诱导的自噬 / EMT / 纤维化

HBV 感染 PHHs 后，自噬、EMT 和纤维化标志物及 p-JNK 表达增加(A、F 图);

沉默 JNK 可抑制这些指标，且 TGF-β1 或自噬增强剂无法恢复(B、C 图);

沉默 ATG5/ATG7 也抑制相关标志物及 JNK1 表达(D、E 图)。

在原代肝细胞中验证了 HBV-JNK - 自噬 - EMT / 纤维化通路。

研究结论

本研究通过 HepAD38、Huh7.5.1-NTCP 及 PHHs 模型证实，HBV 复制或感染可通过其 X 和 C 蛋白激活 JNK，诱导自噬，进而促进 EMT、肝纤维化和 HCC 进展;TGF-β1 部分参与该过程，但 JNK 是更关键的调控因子，其沉默可显著抑制 HBV 诱导的自噬、EMT 和纤维化。该研究揭示了 HBV-JNK - 自噬 - EMT / 纤维化信号轴，提示 JNK 可能成为 HBV 相关肝纤维化和 HCC 的潜在治疗靶点。