微创高效！负载纳米粒的快速溶解微针阵列，为疫苗递送开辟新路径

同源异体小鼠肿瘤模型是免疫肿瘤学(I/O)研究中不可或缺的临床前模型，但它们对免疫检查点抑制剂(ICIs)的反应有限，这可能是由于它们的固有低免疫原性。为了解决这一问题，研究人员通过将鸡卵清蛋白(OVA)这一高度免疫原性的蛋白质表达到同源异体肿瘤细胞中，开发了新的免疫原性同源异体模型。这些模型，如DC2.4-OVA和B16-OVA，显示出比它们的亲本细胞系更慢的肿瘤生长速度，这可能是由于免疫介导的排斥反应。更重要的是，这些OVA表达的模型对ICIs，特别是抗PD-1治疗，表现出更高的敏感性，这表明它们在增强T细胞介导的免疫反应方面具有潜力。此外，通过过继T细胞转移实验，研究人员验证了这些模型中存在肿瘤特异性记忆T细胞。这些结果表明，OVA工具细胞不仅增强了对ICIs的反应，而且为临床前免疫治疗评估提供了新的、具有更高免疫原性的同源异体模型，这对于I/O研究具有重要的意义。

基本信息

英文标题：A fast-dissolving microneedle array loaded with chitosan nanoparticles to evoke systemic immune responses in mice

中文标题：负载壳聚糖纳米粒的快速溶解微针阵列在小鼠中引发全身性免疫应答

发表期刊：《Journal of Materials Chemistry B》

影响因子：5.7

作者单位：

1. 四川大学华西药学院，靶向药物输送系统教育部及四川省重点实验室，植物源药物四川省工程实验室，药物精准工业技术四川省研究中心，成都 610041，中国

2. 四川大学华西第二医院药剂科，出生缺陷与相关妇儿疾病教育部重点实验室，成都 610041，中国

作者信息：

Zhilin Li, Yingju He, Li Deng, Zhi-Rong Zhang, Yunzhu Lin

研究背景

传统疫苗接种依赖皮下 / 肌内注射，存在需专业操作、疼痛、针头废物处理等问题，尤其在中低收入地区应用受限。微针阵列(MN)作为经皮给药新工具，可穿透皮肤角质层，靶向表皮免疫细胞，且微创、易操作。壳聚糖(CS)纳米粒因生物相容性好、能通过静电作用负载抗原和佐剂，可提高抗原摄取效率并靶向淋巴结，增强免疫应答。本研究构建负载壳聚糖纳米粒(共载模型抗原 OVA 和佐剂 CpG)的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)基快速溶解微针阵列，评估其递送效率及诱导的免疫应答，为经皮疫苗递送提供新平台。

研究方法

壳聚糖纳米粒(CS–OVA–CpG NPs)制备与表征：通过静电作用制备共载 OVA(模型抗原)和 CpG(佐剂)的 CS 纳米粒，测定其粒径、zeta 电位、包封率，透射电镜(TEM)观察形态。

微针阵列(MN)制备与表征：将 CS–OVA–CpG NPs 负载到 PVP 基微针尖端，表征微针形态(15×15 阵列，针高 600μm)、抗原负载均匀性，测试机械性能、皮肤插入性及溶解动力学(体内 3 分钟内完全溶解)。

生物相容性评估：通过大鼠皮肤刺激实验(观察红斑、水肿)和组织切片 H&E 染色，评估微针的生物安全性。

细胞摄取实验：DC2.4 树突状细胞与 CS–OVA–CpG NPs 共孵育，流式细胞术和共聚焦显微镜检测细胞摄取效率。

体内靶向与免疫应答评估：小鼠经微针或皮下注射给药后，通过 IVIS 成像系统检测纳米粒在小鼠腹股沟淋巴结的积累;将小鼠分为 6 组(生理盐水皮下注射、游离 OVA+CpG 皮下注射、CS–OVA–CpG NPs 皮下注射、生理盐水微针、游离 OVA+CpG 微针、CS–OVA–CpG NPs 微针)，每间隔 1 周免疫 3 次，收集血清和脾脏样本;采用 ELISA 检测血清中 OVA 特异性 IgG、IgG1、IgG2a 抗体水平及脾细胞分泌的 IL-4、IFN-γ 细胞因子;通过 CCK-8 法计算脾细胞增殖指数，评估细胞免疫应答。

实验结果

图1：CS–OVA–CpG 纳米粒的制备与表征

A 图为纳米粒合成示意图(CS 与 OVA 形成复合物后加入 CpG);

B-C 图 TEM 显示 CS–OVA 复合物和 CS–OVA–CpG NPs 均为近球形，平均粒径约 60 nm;

纳米粒包封率高(OVA 80.03%、CpG 98.99%)，zeta 电位 25.8 mV。

结果证实纳米粒可通过静电作用有效负载抗原和佐剂，尺寸适合淋巴结靶向。

图2：负载纳米粒的 PVP 微针阵列表征

A 图为微针制备流程(纳米粒与 PVP 混合后加压载入模具);

B-D 图显示微针为 15×15 阵列(针高 600 μm)，形态规则;

E-G 图荧光成像证实纳米粒集中分布于针尖;

H-I 图半定量分析显示单阵列内及不同阵列间抗原负载均匀(p>0.05)。

结果验证微针负载均匀性，且纳米粒不影响微针机械性能。

图3：微针溶解动力学、插入性与生物相容性

A-B 图显示微针插入小鼠皮肤后 3 分钟内完全溶解;

C 图台盼蓝染色证实微针可穿透大鼠皮肤角质层;

D-E 图 H&E 切片显示微针穿透深度约 150 μm(达表皮层);

F 图大鼠皮肤给药后 7 天内无明显红肿，炎症反应轻微。结果表明微针可快速溶解、有效插入且生物相容性良好。

图4：DC2.4 细胞对 CS–OVA–CpG NPs 的摄取

流式细胞术显示，与游离 OVA 相比，纳米粒处理 1 小时后细胞摄取效率从 20.37% 升至 64.2%，2 小时达 93.37%(p<0.0001);

共聚焦图像显示纳米粒组细胞内荧光更强。

结果证实纳米粒可显著提高树突状细胞对 antigen 的摄取效率。

图5：纳米粒的淋巴结靶向性

体内成像显示，微针或皮下注射后 24 小时，CS–OVA–CpG NPs 组腹股沟淋巴结荧光强度显著高于游离 OVA 组;

离体淋巴结成像及半定量分析进一步验证纳米粒在淋巴结的特异性积累。

结果表明纳米粒可高效靶向外周淋巴结。

图6：体内免疫应答评估

B-D 图 ELISA 显示，CS–OVA–CpG NPs 微针组诱导的 OVA 特异性 IgG、IgG1、IgG2a 抗体滴度与皮下注射组相当，且高于游离抗原组;

E-F 图脾细胞分泌的 IL-4(Th2 型)和 IFN-γ(Th1 型)水平显著升高;

G 图脾细胞增殖指数显著高于对照组(p<0.01)。

结果证实该体系可诱导强烈的体液和细胞免疫应答。

研究结论

本研究构建的 PVP 基快速溶解微针阵列可在 3 分钟内完全溶解，高效递送负载 OVA 和 CpG 的壳聚糖纳米粒;纳米粒通过提高树突状细胞摄取效率、靶向淋巴结，显著增强免疫应答，其诱导的抗体水平和细胞因子分泌与传统皮下注射相当，但更微创、易操作;微针生物相容性良好，抗原负载均匀。该体系为经皮疫苗递送提供了高效、安全的新平台，尤其适用于资源有限地区的自接种场景。