三维微环境重编程在体外毛囊诱导中的应用

毛囊作为一个独特的微器官，在胚胎发育过程中通过上皮-间质相互作用(EMIs)进行形态发生，并在出生后经历周期性再生。虽然已有研究利用小鼠模型阐明了Wnt信号通路等关键机制在毛囊形态发生中的作用，但由于体内环境的复杂性，完全阐明EMIs的分子机制仍具挑战性。近年来，三维培养和类器官技术为理解组织发育提供了简化而可重复的模型系统。

目前已有研究尝试通过解离的胚胎上皮细胞和间质细胞重建毛囊胚芽(HFG)样聚集体，移植到裸鼠皮肤后能产生新生毛囊。然而，在体外培养中诱导毛囊新生仍面临重大挑战，包括成熟毛囊结构(如真皮乳头和隆起区)的生成以及长毛发的生长。虽然利用多能干细胞可生成包含毛囊的皮肤类器官，但该方法需要多个分化步骤，耗时较长，且毛发长度相对较短。

先前研究团队已开发出通过胚胎背侧上皮和间质细胞自组织工程HFG样聚集体的方法，在微孔阵列板中培养时，两种细胞类型最初随机分布，随后在3天内空间分离形成HFG样结构。移植到裸鼠皮肤后能高效产生新生毛囊并表现正常毛发周期。然而，在体外长期培养中毛囊的出现极为罕见，这限制了其在毛囊发育机制研究和药物筛选中的应用。

日本横滨国立大学Fukuda, J.教授团队在Science Advances期刊上发表了一篇题为Reprogramming of three-dimensional microenvironments for in vitro hair follicle induction的研究论文，该研究建立了一个高效的体外毛囊诱导系统，实现了近100%的毛囊生成效率和长达3毫米的毛发生长，为毛囊发育机制研究提供了重要的技术平台。

研究结果

1，微环境调控实现高效毛囊诱导：研究发现，在培养基中添加低浓度(2% v/v)的Matrigel显著改善了毛囊萌发效率，从不足1%提升至接近100%。与常规培养相比，添加Matrigel的培养条件下，上皮和间质细胞形成了独特的核壳结构，即上皮细胞位于核心，间质细胞包围外层，而非传统的哑铃状结构。这种空间重排在培养第2天开始出现色素化区域，随后萌发毛囊结构。通过优化实验条件，包括Matrigel添加时间、细胞比例和细胞总数，确定了最佳培养参数：细胞比例1:1，总细胞数20×10³，在接种后立即添加Matrigel并在4°C冷却30分钟。

2，毛囊类器官的形态学特征分析：生成的毛囊类器官(hair follicloids)具备典型的毛囊结构特征。组织学分析显示，毛囊类器官表达多种特异性标记物，包括脂肪组织标记物油红O、立毛肌标记物α-SMA、毛囊干细胞标记物CD34和Sox9、基底角质细胞标记物K5、增殖细胞标记物Ki67、真皮乳头细胞标记物versican、黑色素体标记物gp100和TRP1，以及黑色素细胞干细胞标记物c-Kit。扫描电镜观察发现，生成的毛发具有典型的毛小皮结构和髓质。透射电镜显示毛发横截面包含毛小皮和黑色素颗粒，与天然毛发相似。在长期培养中，毛发长度可达约3毫米。

图 1 毛囊类器官制备的示意图

3，分子机制的深入解析：通过PCR阵列和转录组分析揭示了Matrigel促进毛囊形成的分子机制。ECM和细胞粘附分子PCR阵列显示，80个基因中有39个显著上调，包括纤连蛋白-1(Fbln1)、纤连蛋白(Fn1)、层粘连蛋白、胶原蛋白和基质金属蛋白酶(MMPs)等。全基因组表达分析表明，与毛囊和表皮发育相关的基因在Matrigel(+)条件下差异表达。KEGG通路分析显示NF-κB和PI3K-Akt信号通路显著激活。功能验证实验证实，NF-κB抑制剂MG132和PI3K抑制剂LY294002均能完全抑制体外毛囊萌发，表明这两个信号通路在毛囊形态发生中的关键作用。

4，Wnt信号通路的调控作用：Wnt信号通路PCR阵列分析显示，在培养第4天(萌发开始时)，77个Wnt相关基因中有20个上调。特别是参与毛囊发育的关键基因Apc、Axin1、Lef、Lrp5和Wnt10b表达显著增加。免疫荧光染色显示，毛囊类器官外层形成了类似HFG的结构，含有Wnt10b阳性细胞，类似于胚胎皮肤。Wnt信号拮抗剂XAV-939能显著减少Wnt10b阳性细胞数量，抑制HFG样结构形成和后续毛囊萌发，进一步证实了Wnt信号在毛囊新生中的重要性。

图 2 毛囊类器官的表征

5，毛发色素沉着的动态监测：利用该体外毛囊模型，研究团队成功监测了毛球区黑色素体的产生和转运过程。α-黑色素细胞刺激激素(α-MSH)处理显著增强毛发黑色素沉着，生成深黑色毛发，总黑色素含量显著增加。α-MSH处理还上调了四个色素沉着相关基因TYRP1、TYRP2、TYR和MITF的表达。相反，黑色素体转运相关基因Rab27a的拮抗剂Nexinhib20处理导致灰色毛发生成，模拟了Griscelli综合征的表型，黑色素总量显著减少，相关色素基因表达下调。

6，ECM成分的系统性评估：为确定促进毛囊类器官形成的关键成分，研究团队测试了多种ECM成分，包括层粘连蛋白、IV型胶原、肠激酶、去生长因子Matrigel、I型胶原和纤连蛋白。结果显示，IV型胶原、层粘连蛋白-肠激酶复合物、去生长因子Matrigel和I型胶原均能实现高效毛发萌发。值得注意的是，I型胶原作为体内最丰富的ECM成分，实现了96%的萌发效率，为建立稳定、经济的培养系统提供了可能。这些结果表明，生长因子和层粘连蛋白并非直接参与毛囊萌发，而是ECM的物理化学特性在核壳聚集体形成中发挥关键作用。

图 3 毛囊类器官及生成毛干的分析

全文总结

该研究成功重现了胚胎毛囊发生过程，揭示了NF-κB和PI3K-Akt信号通路在早期毛囊形态发生中的关键作用，并证实了Wnt信号在毛囊新生中的重要性。更重要的是，该模型为毛发色素沉着机制研究开辟了新途径，能够实时监测黑色素体的产生和转运，并成功模拟了相关疾病表型。这一技术平台在药物筛选、毛囊再生医学和替代动物实验等方面具有广阔的应用前景。同时，该研究为其他需要EMIs的组织器官类器官制备提供了通用性方法，具有重要的方法学价值。