三级胺N-氧化物两性离子脂质促进肌肉选择性mRNA疫苗递送以增强cDC1介导的抗肿瘤疗效

基本信息

英文标题：Tertiary amine N-oxide zwitterionic lipids facilitate muscle-selective mRNA vaccine delivery for enhancing cDC1-mediated antitumor efficacy

中文标题：三级胺N-氧化物两性离子脂质促进肌肉选择性mRNA疫苗递送以增强cDC1介导的抗肿瘤疗效

发表期刊：《Journal of Controlled Release》

影响因子：10.3

作者单位：中山大学材料科学与工程学院、河南大学淮河医院转化医学中心等

作者信息：

Haihong Yang, Zhan Gao, Yizi Zhou等

研究背景

mRNA疫苗的挑战

mRNA疫苗在肿瘤免疫治疗中潜力巨大，但传统脂质纳米颗粒(LNPs)在肌肉注射后易导致肝脏非靶向表达，引发安全性问题(如过度免疫激活或肝损伤)。

现有LNPs的组织特异性不足，需优化辅助脂质以提升靶向性和疗效。

创新点

设计新型三级胺N-氧化物两性离子脂质(AOLs)，替代传统磷脂(DSPC)作为LNPs的辅助脂质。

通过两轮结构筛选(头基优化和疏水尾调整)，获得肌肉选择性高、肝脏脱靶效应低的AOL-LNPs。

结合CpG佐剂，增强cDC1细胞迁移和CD8+ T细胞浸润，显著抑制黑色素瘤生长。

研究方法

AOLs合成与筛选

采用Ugi四组分反应(Ugi-4CR)合成24种AOLs，通过体外(C2C12细胞)和体内(小鼠肌肉注射)筛选最优结构(如I14C14、I16C16)。

LNPs制备与表征

微流控混合法制备AOL-LNPs，粒径<100 nm，mRNA包封率>70%。

透射电镜(TEM)和动态光散射(DLS)验证形貌和稳定性。

免疫与抗肿瘤实验

模型：B16F10-OVA黑色素瘤小鼠模型。

方案：肌肉注射OVA mRNA疫苗(0.25 mg/kg)，联合CpG佐剂评估疗效。

检测指标：

体液/细胞免疫(ELISA、流式细胞术)。

肿瘤体积、生存率、cDC1细胞活化及T细胞浸润。

实验结果

图1：三级胺N-氧化物两性离子脂质(AOLs)的设计与合成及其在肌肉特异性mRNA递送中的应用

(A) 示意图展示了用AOLs替代传统磷脂(DSPC)作为辅助脂质制备脂质纳米颗粒(LNPs)的工艺流程。与传统的DSPC基LNPs相比，基于AOL的LNPs在肌肉注射给药后，不仅显著提升了局部mRNA递送效率，还大幅降低了肝脏中的蛋白质表达水平。

(B) 通过两步反应策略设计合成了一组小型AOLs库，该策略包含一步Ugi-4CR反应，随后对三级胺头部基团进行氧化处理。

图2：针对肌肉选择性mRNA递送的AOLs结构筛选

(A) 第一轮结构筛选中24种基于AOL的脂质纳米颗粒(编号1-24)的粒径和多分散指数(PDI)。以DSPC基LNP(编号0)作为对照组，数据以均值±标准差(SD)表示(n = 3)。

(B) 使用C2C12细胞系进行体外转染实验，采用1 μg/mL Fluc mRNA剂量的AOLs衍生LNP处理，并以DSPC基LNP组作为对照(n = 3)。

(C) 静脉注射0.125 mg/kg mRNA剂量LNP后小鼠的代表性生物发光图像(n = 3)。

(D) 通过肝脏总辐射量量化分析体内mRNA递送效率与胺类、醛类、异氰酸酯类或羧酸类AOLs的构效关系。*p < 0.05，**p < 0.01，数据以均值±标准误(SEM)表示。纵轴虚线代表DSPC基LNP(对照组)在肝脏中的总辐射量。

(E) 肌肉与肝脏总辐射比对应的构效关系分析。*p < 0.05，**p < 0.01，数据以均值± SEM表示。

图3：AOLs疏水尾部优化用于肌肉选择性mRNA递送

(A) AOLs结构优化示意图：通过调节源自异氰酸酯或羧酸的两个疏水尾部实现结构优化。

(B) 体外C2C12细胞转染实验，使用Fluc mRNA剂量为1 μg/mL的基于AOLs的脂质纳米颗粒。I16C16、I16C18、I18C16和I18C18型脂质纳米颗粒的数据来自首轮实验结果(n = 3)。

(C) 小鼠肌肉注射Fluc mRNA封装的脂质纳米颗粒(剂量0.125 mg/kg/只，n=3)后，其生物发光图像及主要器官变化的代表性展示。由A4I18R2C18-2、DSPC、胆固醇和DMG-PEG组成的DSPC型脂质纳米颗粒数据来自首轮实验。基准SM-102型脂质纳米颗粒(SM-102)由SM-102、DSPC、胆固醇和DMG-PEG组成。

(D) Fluc mRNA封装的脂质纳米颗粒在肌肉和肝脏中的表达分布。M/L表示肌肉与肝脏总辐射值比值，数据以log10尺度呈现(n = 3)。

(E-H) 通过微流控混合技术制备的三种Fluc mRNA封装AOLs脂质纳米颗粒的理化性质，包括粒径(E)、粒径分布指数(F)、zeta电位(G)及mRNA包封效率(H)(n = 3)。

(I) 微流控混合法制备的三种AOLs脂质纳米颗粒的代表性冷冻电镜图像。比例尺：100 nm。所有数据均以均值±标准差表示。

图4：LNP-mRNA疫苗显著提升脾脏中CD4⁺TNF-α⁺T细胞和CD8⁺TNF-α⁺T细胞数量

(A-D) C57BL/6J小鼠肌肉注射OVA mRNA封装脂质纳米颗粒及OVA@Al免疫应答的示意图与实验结果。

(A) 免疫方案示意图：小鼠分别接受PBS(对照组)、SM-102脂质纳米颗粒，或基于I14C14、I16C16、I16C18的OVA-mRNA脂质纳米颗粒(每只0.25 mg/kg)及OVA@Al(每只0.5 mg/kg).

(B) 免疫接种后第28天检测的血清抗体效价(n = 5)。

(C、D) 体外用卵清蛋白多肽(5 μg/mL)重新刺激脾细胞的流式细胞术分析。**p < 0.01，****p < 0.0001(n = 5)。

(E) B16F10-OVA同基因异种移植瘤模型的肿瘤接种与免疫接种时间表示意图(n = 7)。

(F) 不同疫苗免疫小鼠的平均肿瘤体积。*p < 0.05，****p < 0.0001。

(G、L) 各治疗组个体肿瘤生长轨迹的蜘蛛图。

(M) 不同LNP-mRNA或OVA@Al疫苗处理小鼠的生存曲线。所有数据均以均值±标准差表示。

图5：C57BL/6J小鼠经不同OVA mRNA-LNP疫苗(每只小鼠0.25毫克/千克OVA mRNA)治疗后表达OVA的黑色素瘤免疫学评估

(A) 流式细胞术分析I14C14、I16C16和I16C18型脂质纳米颗粒及SM102型脂质纳米颗粒治疗后肿瘤微环境中的CD3+ T细胞。*p < 0.05和**p < 0.01(n = 5)。

(B，C) 流式细胞术分析不同脂质纳米颗粒肌肉注射部位的CD3+ T细胞。****p < 0.0001(n = 5)。

(D，E) 流式细胞术分析不同脂质纳米颗粒肌肉注射部位的树突状细胞募集情况。*p < 0.05、***p < 0.001、****p < 0.0001(n = 5)。

(F，G) 流式细胞术分析不同脂质纳米颗粒淋巴结中的树突状细胞水平。*p < 0.05、***p <0.001，****p < 0.0001(n = 5)。

(H，I) 通过流式细胞术分析OVA多肽(5µg/mL)体外再刺激淋巴结后T细胞的活化情况。***p < 0.001，****p < 0.0001(n = 5)。所有数据均以均值±标准差表示。

图6：通过将CpG佐剂与I14C14脂质纳米颗粒(LNP)mRNA疫苗共配制，可增强cDC1细胞迁移并提升抗肿瘤治疗效果

(A) 基于I14C14@CpG的LNP增强抗肿瘤治疗机制示意图。

(B) 经I14C14和I14C14@CpG型LNP(每只小鼠0.25毫克/千克卵清蛋白mRNA和0.5毫克/千克CpG，n = 7)免疫的小鼠平均肿瘤体积。(*p<0.05，****p<0.0001)(C-E)各治疗组个体肿瘤生长轨迹的蜘蛛图。

(F) 不同LNP-mRNA疫苗处理小鼠的生存曲线。

(G、I) 接种后肌肉注射部位树突状细胞(DC)募集的流式细胞术分析。(**p<0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，n=5)

(H、J) 淋巴结内树突状细胞的流式细胞术分析。*p < 0.05，***p <0.001(n = 5)。

(K) 流式细胞术检测淋巴结中T细胞活化情况。**p < 0.01，***p < 0.001(n = 5)。

(L，M) 通过流式细胞术定量分析肿瘤CD8+和CD4+ T细胞。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001(n = 5)。所有数据均以均值±标准差表示。

图7：基于AOL的脂质纳米颗粒(LNPs)体内生物安全性评估

(A) 小鼠体内免疫方案示意图用于安全性评估。

(B) 首次免疫后48小时内体温监测结果(n = 5)。

(B-H) 静脉注射不同LNPs(每只小鼠0.5 mg/kg OVA mRNA)后，肝、肾和心脏功能生物标志物的血清分析结果(n = 5)。对照组与I14C14基LNP的数据见图S19。检测指标包括丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、肌酐(CREA)、尿素氮(UREA)、肌酸激酶(CK)及肌酸激酶MB(CK-MB)。

(I，J) 通过流式细胞术定量分析给药后肝脏T细胞浸润情况。*p < 0.05，***p < 0.001(n = 5)。所有数据均以均值±标准差表示。

研究结论

靶向性与疗效

I14C14-LNPs在肌肉中荧光素酶表达量较肝脏高10倍，脱靶效应显著降低。I14C14组肿瘤抑制率最优，生存期延长(vs. SM-102 LNP)。

免疫机制

AOL-LNPs激活迁移性cDC1(CD11b+CD103+)和淋巴结驻留cDC1(CD8α+)，促进CD8+ T细胞浸润。CpG佐剂进一步将cDC1迁移率提升1.7倍，增强抗肿瘤效果。

安全性

AOL-LNPs肝脏T细胞浸润(5.11%)低于SM-102 LNP(12.4%)，血清生化指标无异常。

机制创新

AOLs通过优化脂质界面相互作用，实现肌肉选择性mRNA递送。

cDC1激活与CpG佐剂的协同作用为肿瘤免疫治疗提供新策略。

转化意义

为下一代mRNA疫苗设计提供安全高效的LNP平台，减少肝脏副作用。