疟原虫研究新突破：高通量筛选锁定 CLAG3 靶点，为抗疟药物开发铺路

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题：A High-Throughput Inhibitor Screen Targeting CLAG3 Export and Membrane Insertion on Human Erythrocytes Infected with Malaria Parasites

中文标题：针对感染疟原虫的人红细胞中 CLAG3 输出及膜插入的高通量抑制剂筛选

发表期刊：《Pathogens》

影响因子：3.3

作者单位：

Laboratory of Malaria and Vector Research, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Rockville, MD 20852, USA

作者信息：

Jinfeng Shao, Jonathan Chu, Kashif Mohammad, Sanjay A. Desai

研究背景

疟疾仍是全球主要的感染性疾病，现有抗疟药耐药性、杀虫剂抗性及疫苗效果有限等问题阻碍了疟疾防控与消除。恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)通过向宿主红细胞输出大量蛋白重塑细胞，以促进自身生长繁殖，其中 CLAG3 蛋白插入红细胞膜，通过疟原虫表面阴离子通道(PSAC)参与关键营养获取，且在所有疟原虫中高度保守。本研究利用分裂型 NanoLuc 报告系统，开展高通量筛选以寻找抑制 CLAG3 运输及膜插入的小分子化合物，旨在揭示疟原虫重塑宿主细胞的机制，并为抗疟药物开发提供候选分子。

研究方法

培养野生型 KC5 克隆及其转染衍生物(8-1-3HA、GBP-HB)的恶性疟原虫，在含 28.6 mM NaHCO₃、25 mM HEPES 等成分的 RPMI 1640 培养基及 90% N₂、5% CO₂、5% O₂环境中维持;利用 8-1-3HA 株(CLAG3 含 HiBiT 片段和 HA 标签)建立基于分裂 NanoLuc 的检测体系，在 384 孔板中对约 52,480 个小分子化合物(16.7 µM)进行初筛，通过 HiBiT 与胞外 LgBit 结合产生的荧光信号量化 CLAG3 膜插入效率，以青蒿素(ART)为阳性对照、DMSO 为阴性对照;经 counterscreen(用滋养体阶段细胞排除直接抑制 NanoLuc 的假阳性)和 GBP-HB 株毒性筛选(评估非特异性毒性)后，对候选化合物进行二次验证，结合 SYBR Green I 荧光法检测生长抑制、免疫荧光实验观察 CLAG3 和 RhopH3 定位，最终通过剂量反应实验确定 EC₅₀和 IC₅₀值。

实验结果

图1：CLAG3 输出抑制剂的微型细胞筛选模型验证

A 图展示野生型 CLAG3 与 8-1-3HA 株的结构(CLAG3 的高变区替换为 HiBiT 和 HA 标签，与胞外 LgBit 结合产生荧光);

B 图显示 384 孔板中 ART 处理组与对照组的荧光信号差异，信号 / 背景比达 5.9;

C 图 Z' 值为 0.60±0.03，表明 assay 稳定性良好;

D 图初筛结果直方图显示 177 个化合物可使荧光信号降低≥50%， hit 率 0.3%。

结果验证了筛选模型的可靠性，为高通量筛选奠定基础。

图2：排除抑制 NanoLuc 的假阳性的二次筛选

A 图显示不同孔板列的荧光信号，对照组与化合物组差异明显;

B 图二次筛选直方图显示仅 17 个化合物抑制 NanoLuc≥50%;

C 图散点图显示化合物分为两类：仅抑制 NanoLuc(沿对角线分布)和抑制 CLAG3 输出(沿红线分布)。

结果有效区分了假阳性，提高了筛选特异性。

图3：候选化合物的复测和效价研究

A 图显示 19 个复测化合物的初筛与复测结果高度相关;

B 图剂量反应实验表明多数化合物 EC₅₀在低微摩尔范围，部分达亚微摩尔。

结果验证了候选化合物的活性及效价，支持筛选策略的有效性。

图4：免疫荧光实验观察 CLAG3 和 RhopH3 定位

DMSO 对照组中 CLAG3 和 RhopH3 正常输出，ART 组输出减少;

候选化合物(如 PEI-6、PEI-10)处理后，CLAG3 和 RhopH3 定位无明显变化，但寄生虫成熟受抑(体积变小)。

结果提示候选化合物可能通过非特异性毒性影响寄生虫成熟，而非直接抑制 CLAG3 输出。

图5：不同培养基中生长抑制 IC₅₀值

候选化合物在 RPMI 1640 与 PGIM(低营养)培养基中的 IC₅₀无明显差异，与 PSAC 抑制剂在 PGIM 中活性增强的预期不符。

结果进一步支持化合物通过非特异性机制发挥作用。

图6：GBP-HB 报告系统评估非特异性毒性

A 图展示 GBP-HB 株结构(表达胞内 HiBiT 融合蛋白);

B 图显示候选化合物对 GBP-HB 的抑制率与对 8-1-3HA 的抑制率相当或更高;

C 图 PSAC 特异性抑制剂 MBX-2366 对 GBP-HB 无明显抑制。

结果证实候选化合物主要通过非特异性毒性发挥作用。

研究结论

本研究建立了基于分裂 NanoLuc 的高通量筛选体系，对约 52,000 个小分子化合物进行筛选，经二次筛选排除假阳性后获得 19 个活性化合物，但进一步验证表明这些化合物通过非特异性毒性抑制寄生虫成熟，而非直接靶向 CLAG3 输出或膜插入。尽管未发现真正的 CLAG3 抑制剂，本研究确立了区分特异性与非特异性作用的筛选框架，为更大规模筛选及抗疟药物开发(靶向疟原虫蛋白输出机制)提供了方法学基础。