基于人类结直肠癌类器官模型的免疫原性细胞死亡研究方法

免疫原性细胞死亡(ICD)是一种特殊的调节性细胞死亡形式，能够在免疫功能完整的环境中激活适应性免疫反应。自2005年首次被描述以来，ICD已成为癌症治疗研究的重要方向。当肿瘤细胞经受特定刺激如病原体或化疗药物作用时，会发生时空特异性的损伤相关分子模式(DAMPs)释放，这一过程涉及树突状细胞募集、抗原处理、成熟和向T细胞呈递抗原的逐步过程。

在癌症治疗背景下，多种化疗药物能够诱导ICD，通过DAMPs释放将肿瘤微环境从惰性转变为免疫原性，从而产生有利的治疗反应。化疗诱导的ICD相关免疫刺激性DAMPs主要包括：钙网蛋白(CALR)在质膜上的暴露、三磷酸腺苷(ATP)的释放以及高迁移率族蛋白1(HMGB1)的释放。CALR作为内质网相关伴侣蛋白，在eIF2A磷酸化依赖过程中转位至死亡细胞质膜，充当树突状细胞的“eat-me”信号。ATP在ICD早期阶段释放，作为“find-me”信号吸引并激活抗原呈递细胞。HMGB1作为核蛋白在ICD晚期胞外释放，作为“警报素”结合受体如TLR2、TLR4和RAGE，促进树突状细胞成熟和细胞毒性T淋巴细胞激活。

2025年6月6日，发表在Oncotargets And Therapy上题为Studying Immunogenic Cell Death in Human Colorectal Cancer Organoids的研究旨在优化体外检测方法，以评估化疗药物诱导的ICD相关DAMPs释放，使用人类结直肠癌类器官(CRC PDOs)模型。

研究中，CRC PDOs经奥沙利铂(OXA)或5-氟尿嘧啶(5FU)处理后，通过细胞活力检测、免疫荧光显微镜和特定的荧光素酶测定法，分别评估细胞活力、CALR和HMGB1的细胞内转位以及ATP的胞外释放。研究结果表明，CRC PDOs对OXA和5FU治疗的DAMPs释放反应具有患者特异性。该研究成功利用免疫荧光和荧光素酶方法检测了CRC PDOs中化疗诱导的ICD相关DAMPs释放，为识别患者特异性的ICD激活提供了可能，有助于预测患者对治疗的反应。

研究结果

1，患者来源类器官对奥沙利铂和5-氟尿嘧啶的敏感性分析。

研究者选择了5个CRC PDOs(CRC02、CRC12、CRC13、CRC17、CRC19)进行药物敏感性评估。结果显示，不同PDOs对治疗的反应随时间变化存在差异，其中CRC13和CRC19对奥沙利铂(OXA)治疗表现出最显著的效果。值得注意的是，CRC13和CRC19均被归类为微卫星不稳定(MSI)类型，它们对治疗的高敏感性与先前报告一致，即缺陷性错配修复(dMMR)/MSI CRC细胞系在体外表现出对化疗药物的敏感性。在选择的微卫星稳定(MSS) PDOs中，CRC17对OXA显示出最高的敏感性。研究显示CRC17属于转录上更接近MSI-High肿瘤而非MSS组的小部分MSS肿瘤，这与观察到的对OXA的敏感性一致。当用5-氟尿嘧啶(5FU)处理时，MSI PDOs的反应与MSS相似，显示出比OXA治疗观察到的敏感性更低的程度。

2，钙网蛋白暴露分析。

CALR在质膜上的暴露是ICD早期阶段的标志性特征。研究者优化了免疫荧光显微镜方案来分析CALR向质膜的转位。通过计算CALR与小麦胚芽凝集素(WGA)的共定位，以重叠系数(OC)表示CALR的暴露程度。结果显示，OXA处理诱导CRC12和CRC13的质膜上CALR定位增加，相比于未处理对照组有显著差异。相反，所有PDOs在5FU处理后均未显示质膜上CALR的积累。这一结果证实了OXA作为强ICD诱导剂而5FU作为中等ICD诱导剂的先前认知，并展示了患者特异性的CALR转位反应。

3，细胞外ATP释放测定。

ATP从死亡细胞释放是ICD的主要标志之一。研究者改进了已建立的发光分析法来检测PDOs在OXA或5FU处理后相比于未处理PDOs的细胞外ATP释放。结果显示，OXA处理诱导了CRC02、CRC12、CRC13和CRC19的ATP分泌。当PDOs用5FU处理时，CRC19显示出ATP分泌的中等增量，而其他PDOs的细胞外ATP水平在5FU处理后未受影响。ATP释放实验进一步证实了OXA在诱导ICD相关DAMPs释放方面的优势，并揭示了不同PDOs间ATP分泌能力的患者特异性差异。这种差异性反应模式为个体化治疗策略的制定提供了重要参考。

4，HMGB1释放分析。

HMGB1的死后释放是ICD的典型特征。研究者优化了免疫荧光显微镜方案来分析HMGB1从细胞核向细胞质的转位。通过计算HMGB1与DAPI的共定位来量化HMGB1向细胞质的释放。结果显示，OXA处理诱导了CRC12、CRC13和CRC19中定位于细胞核的HMGB1减少，相比于未处理对照组有显著差异，而PDOs在5FU处理后HMGB1的定位未发生改变。这些结果与CALR暴露和ATP分泌分析一致，表明5FU在CRC PDOs中不能一致地触发DAMPs，而OXA特异性地在PDOs亚群中触发ICD相关DAMPs。综合分析显示，在所分析的PDOs中，CRC13和CRC12在OXA处理后触发了三种主要ICD相关DAMPs的释放。值得注意的是，这两个PDOs在细胞活力随时间变化方面对OXA处理的反应不同，CRC13显示出比CRC12更高的敏感性。这一观察表明，化疗药物诱导的DAMPs释放可能不一定与体外细胞活力的快速降低相关。基于所进行的DAMPs释放分析，可以假设CRC13和CRC12都是ICD诱导化疗与免疫检查点阻断剂联合治疗的潜在良好应答者，这强调了开发能够识别体外患者特异性ICD激活的实验方法的重要性。

全文总结

本研究成功开发并优化了一套基于3D类器官模型检测ICD相关DAMPs释放的实验方法体系。相比传统2D细胞培养模型，3D PDOs能更好地保持肿瘤内和肿瘤间异质性，更真实地反映患者肿瘤的特异性。研究建立的免疫荧光和发光检测方法可有效识别患者特异性的ICD激活，为预测患者对化疗和免疫检查点阻断剂联合治疗的反应提供了新途径。通过检测不同患者来源类器官对化疗药物的ICD反应差异，为临床医生制定精准治疗方案提供科学依据，推动了个体化精准医疗的发展，为ICD研究从传统2D细胞单培养系统向患者来源3D异质细胞类型系统的转变铺平了道路，有助于将基础临床前研究转化为新型治疗方法。