LCN2介导的铁死亡抗性在输卵管上皮组织稳态和早期肿瘤发生中的作用

输卵管上皮(FTE)是女性生殖系统的重要组成部分，也是高级别浆液性癌(HGSC)这一最常见卵巢癌亚型的潜在起源部位。人类输卵管分为三个功能区段：伞端负责捕获排卵后的卵细胞，壶腹部是受精发生的部位，峡部负责将胚胎运输至子宫进行着床。近期研究已经绘制了人类输卵管的细胞组成图谱，发现其包含上皮细胞、间质细胞和免疫细胞。输卵管是一个动态器官，其上皮在每次排卵过程中都会暴露于富含多种激素、生长因子和离子的复杂微环境中。雌激素通过上皮生长因子受体(EGFR)通路促进FTE细胞向纤毛细胞的终末分化。虽然纤毛细胞被认为是FTE分化的最终阶段，但分化过程中的上游细胞仍在研究中。

先前研究表明，人类输卵管是间充质干细胞的丰富来源，也有报道在小鼠FTE中检测到静息干细胞样细胞。一般而言，静息组织干细胞的特征是分裂速度缓慢且能够保持休眠状态，在氧化应激和激素变化的条件下保护自身免受基因突变的积累。这些静息细胞对维持组织稳态至关重要。然而，当长期暴露于应激或致突变因子时，这些静息细胞可能发生致癌转化，最终导致癌症。因此，研究这些关键静息细胞在各种环境因子(如氧化应激)下的保护机制，对于理解组织异常和肿瘤发生至关重要。

近日，发表在Iscience上题为LCN2-mediated ferroptosis resistance in tissue homeostasis and early-stage tumorigenesis of the fallopian tube epithelium的研究首先成功建立了人类FTE类器官，并通过观察细胞增殖的异质性，识别出早期类器官形成中的静息细胞。进一步分析了两个单细胞转录组数据，追踪了人类FTE中的分化轨迹，并发现基因LCN2是早期分化轨迹的标记基因。

通过遗传操作的FTE类器官实验，研究人员发现LCN2能够抑制铁死亡，并在氧化应激下促进细胞存活。此外，引入p53功能障碍(这是高级别浆液性癌的常见遗传特征)的FTE类器官显示出上调的LCN2表达和增强的铁死亡抗性。本研究为人类FTE静息细胞的保护机制提供了见解，并揭示了其在肿瘤发生中的潜在作用。

研究结果

1，人类FTE类器官的建立与表征。

研究团队成功建立了人类FTE类器官培养系统，并通过时间序列观察发现类器官从第15天开始逐渐出现折叠结构。免疫组织化学分析显示，人类输卵管上皮由PAX8阳性的分泌细胞和α-微管蛋白阳性的纤毛细胞组成。在类器官培养中，PAX8在第15天即可良好染色，而α-微管蛋白直到第20天才在细胞表面呈现良好染色，表明类器官能够重现人类输卵管的组织学特征。通过qPCR分析发现，随着培养时间延长(第8-20天)，分泌细胞标志物OVGP1和纤毛细胞标志物FOXJ1的表达逐渐增加，而增殖标志物MKI67的表达则逐渐下降，提示类器官在分化过程中增殖逐渐下调。

2，早期培养类器官中静息细胞的鉴定。

为了评估FTE类器官中个体细胞的增长速度，研究者使用红色荧光膜染料PKH26对细胞进行标记。PKH26锚定在细胞膜上，随细胞分裂而稀释，因此可将PKH26保留细胞定义为静息细胞，PKH26减少细胞定义为增殖细胞。结果显示，在一周后观察到两个具有不同PKH26荧光强度减少速率的细胞群体。通过流式细胞术在第6天将细胞分选为PKH26保留细胞和PKH26减少细胞，并进行转录组分析。基因富集分析(GSEA)显示，PKH26保留细胞中与细胞周期相关的基因表达下调。类器官形成实验证实，PKH26减少细胞的扩增速率高于PKH26保留细胞，成功验证了基于增殖速率对静息细胞和增殖细胞的分类。

3，细胞分化轨迹分析。

基于PKH26保留静息细胞中上调的47个基因建立了休眠基因集，并使用AUCell分析评估该基因集在scRNA-seq数据中的富集情况。结果发现，具有上调休眠基因集的PKH26保留静息细胞位于OVGP1低表达的分泌细胞区域内。通过构建转录组转换轨迹并计算伪时间，发现NF-κB信号在轨迹早期被激活，并随伪时间在分泌细胞区域中逐渐下降。EGFR信号在纤毛细胞区域被下调，这与EGFR信号作为纤毛发生调节因子的报道一致。通过Moran's I检验分析基因表达的空间相关性，获得了1,288个在细胞分化中重要的基因。

4，LCN2作为干细胞标志基因的鉴定。

为了检测在伪时间中单调递减的重要基因，研究者建立了自然样条函数模型并计算各伪时间点的导数。最终筛选出14个在所有定义的时间点导数均小于0的基因，其中编码脂质运载蛋白-2的LCN2在PKH26保留细胞中显示最高的TPM值，且其表达量是PKH26减少细胞的三倍以上。体外实验证实，β-雌二醇诱导的细胞分化增加了OVGP1和FOXJ1的表达，同时将LCN2的表达降低至0.647倍。人类输卵管样本的免疫组织化学分析也显示LCN2在非纤毛细胞中呈异质性表达。

5，LCN2对铁死亡的抑制作用。

LCN2蛋白与通过三价铁离子运输的免疫反应相关，近期研究报道LCN2的表达与癌细胞中NF-κB的激活相关。三价铁可被还原为二价铁，参与芬顿反应产生活性氧，诱导铁死亡这一细胞死亡类型。实验显示，含三价铁培养基对人类FTE具有细胞毒性作用。建立LCN2过表达的FTE类器官(LCN2-OE)后发现，LCN2过表达不影响类器官形态和形成，但使类器官对三价铁诱导的铁死亡产生抗性。化学敏感性实验证实，LCN2-OE类器官对青蒿素和Erastin(两种铁死亡诱导剂)诱导的铁死亡更加耐受，表明LCN2能够减少铁死亡并使人类FTE的静息细胞在暴露于三价铁时能够存活。

6，p53功能障碍与铁死亡抗性的增强。

大多数HGSC病例具有TP53致病性突变，p53功能障碍被认为在HGSC致癌过程中发挥重要作用。研究发现，在BRCA2致病性变异携带者的风险降低性输卵管卵巢切除术标本中发现的极早期HGSC(IA期)与正常FTE相比，LCN2高表达。在18个临床FTE样本中发现的p53染色异常的输卵管上皮内癌(STIC)病变中，LCN2表达增加。通过CRISPR/Cas9技术建立TP53敲除的FTE类器官(p53-KO)，发现p53功能障碍减少了分化标志基因OVGP1和FOXJ1的表达，同时激活了LCN2的表达。p53-KO类器官中NF-κB信号下游基因(TNF、IL1A、IL1B和IL6)的表达分别增加了4.23倍、6.40倍、4.87倍和2.75倍。敏感性实验显示，p53功能障碍使铁死亡抗性增强了1.29倍，表明p53功能障碍通过激活NF-κB信号和上调LCN2表达，增强了对铁死亡的抗性。

全文总结

本研究系统揭示了人类输卵管上皮(FTE)中静息细胞的特征及其保护机制，发现LCN2介导的铁死亡抗性是维持FTE干细胞龛位的关键。研究显示，p53功能障碍通过激活NF-κB信号通路和上调LCN2表达，增强细胞对氧化应激的抗性，从而促进早期致癌过程，而非通过促进细胞增殖。这一发现不仅深化了对组织稳态维持机制的理解，还为高级别浆液性癌(HGSC)的早期诊断和治疗提供了新的分子靶点。此外，LCN2在血液中的可检测性使其有望成为HGSC早期诊断的生物标志物，具有重要的临床应用前景。