癌症相关成纤维细胞与卵巢癌类器官共培养模型构建及耐药机制

卵巢癌是妇科恶性肿瘤中致死率最高的疾病，约70%的患者在确诊时已处于晚期。尽管铂类化疗药物通常具有较高的初始治疗效果，但约70-80%的患者会出现疾病复发，表明存在高耐药率问题。已确立的耐药机制包括损伤识别机制缺失、HER-2/neu过表达、PI3K-Akt信号通路激活、P53功能缺失、BCL-2过表达以及胱天蛋白酶激活干扰等。然而，卵巢肿瘤细胞的异质性和肿瘤微环境(TME)中复杂的细胞-细胞相互作用使得耐药机制的理解更加复杂。

癌症相关成纤维细胞(CAFs)作为TME的重要组成部分，已被广泛验证能够促进肿瘤发生、进展并促进治疗耐药性。因此，有必要开发能够高度模拟TME的体外模型来研究CAFs对耐药性的影响。迄今为止，大多数关于CAFs的研究都采用二维(2D)癌细胞系模型，但这些模型无法有效模拟肿瘤细胞与CAFs之间复杂的相互作用环境，且2D细胞培养无法维持肿瘤的异质性和表观遗传一致性。近年来，三维(3D)类器官培养技术的发展使得利用患者肿瘤组织构建3D肿瘤类器官模型成为可能。这些模型在组织学特征、生物标志物表达和遗传特征方面与原始组织高度相似，为癌症生物学研究提供了更可靠的结果。

近期，山西医科大学第一医院赵烨团队发布在Experimental cell research期刊，题为Constructing a co-culture model of cancer-associated fibroblasts and ovarian cancer organoids and studying mechanisms of drug resistance的研究目的是提供一个可靠的研究平台，以促进卵巢癌的研究，并阐明癌症相关成纤维细胞(CAFs)在促进耐药性过程中涉及的潜在机制。

研究结果

1，CAFs和卵巢癌类器官的成功建立

研究团队成功从高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)患者组织中分离并培养了CAFs和类器官。通过塑料贴壁法富集CAFs，细胞呈现典型的拉长、纺锤状形态。免疫荧光染色显示大多数CAFs对α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和成纤维细胞激活蛋白(FAP)呈阳性表达，证实了分离的细胞确实是处于激活状态的CAFs，且未被其他细胞类型污染。经过三周培养，卵巢癌类器官成功建立，早期类器官主要由单细胞或小细胞簇组成，成熟的类器官通常表现为直径约20-200μm的多细胞囊性结构。H&E染色和免疫组化染色显示类器官中卵巢癌相关标志物WT-1和PAX-8呈阳性表达，与原发肿瘤组织的表达趋势一致，表明构建的类器官在组织学和表型上与来源肿瘤相匹配。

图1 人类卵巢癌相关成纤维细胞与类器官模型的建立

2，CAFs促进类器官生长的共培养模型建立

为研究癌细胞与CAFs之间的相互作用，研究团队构建了包含卵巢癌类器官和CAFs的3D共培养系统。随着培养时间的延长，CAFs进一步伸长，逐渐形成包围类器官的网状结构。部分类器官显示不规则轮廓，表明多个类器官(或细胞)之间发生了融合事件。经过10天的共培养，对消化的单个类器官细胞与CAFs进行计数和测量，观察到CAFs共培养导致形成的类器官尺寸增大，但对数量没有影响。具体而言，共培养组类器官的平均直径显著大于单独培养组，而两组间类器官数量无显著差异。这些结果表明CAFs可能不调节类器官起始的效率，而是促进共培养系统中已形成类器官的生长。

图2 建立类器官与癌症相关成纤维细胞的3D共培养模型

3，CAFs保护癌症类器官免受药物治疗影响

研究进一步检验了CAFs对癌症类器官响应抗癌药物(紫杉醇和顺铂)的影响。在存在或不存在CAFs的情况下，用紫杉醇和顺铂处理卵巢癌类器官。经72小时药物暴露后，共培养系统中的类器官对两种药物均表现出显著增强的耐药性。值得注意的是，与共培养组相比，仅类器官组的药物反应曲线下面积(AUC)明显较小。仅类器官组中紫杉醇和顺铂的IC50值分别为7.151e-006和2.340e-005，而与CAFs共培养后，IC50值分别增加到2.556e-005和4.500e-005，表明药物敏感性降低，与CAFs共培养后出现了显著的耐药性。这一发现证实了CAFs在肿瘤耐药性发展中的重要作用。

图3 分析类器官药物治疗及其与癌症相关成纤维细胞(CAFs)共培养的曲线下面积(AUC)

4，多重信号通路参与CAFs促进耐药性的机制

为阐明CAFs诱导类器官耐药性的机制，研究团队对CAFs共培养类器官和单独培养类器官进行了转录组分析。结果显示，在检测到的14,681个基因中，有674个差异表达基因(DEGs)，其中581个基因在共培养组中上调，93个基因下调。GO富集分析显示DEGs主要定位于基底膜和细胞外基质(ECM)。KEGG通路分析表明PI3K-Akt信号通路、粘着斑、细胞因子-细胞因子受体相互作用、癌症中的蛋白聚糖和ECM-受体相互作用等通路在CAFs共培养组中显著富集。在细胞过程类别中，与单独培养类器官相比，CAFs共培养组中的DEGs在粘着斑和肌动蛋白细胞骨架调节通路中表现出最大的富集。在环境信息处理类别中，PI3K-Akt信号通路最显著富集，占DEGs的12.29%(37/462)，其次是细胞因子-细胞因子受体相互作用和MAPK信号通路，分别富集7.97%和5.98%。通过基因集富集分析(GSEA)进一步验证，PI3K-Akt信号通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用相关基因在共培养组中上调并发挥重要作用。Western blot验证了四个代表性基因(CXCL12、IGF1、ITGA4和PDGFRB)的蛋白表达水平，结果与RNA-seq分析一致。

图4 类器官单独培养与癌症相关成纤维细胞共培养类器官的RNA测序分析

5，高表达卵巢癌相关成纤维细胞特征与临床预后不良相关

研究利用共培养类器官中上调的CAF相关基因构建了卵巢癌来源CAF(OV.CAF)特征，该特征代表卵巢癌中CAF相关基因的表达并验证其潜在的临床影响。通过分析三个公共基因表达谱数据集计算OV.CAF特征的ssGSEA评分，以0.75为阈值。结果显示，在所有三个独立数据集中，OV.CAF特征表达升高的患者均表现出不良预后。进一步分析TCGA-OV队列中OV.CAF特征高表达组和低表达组之间的DEGs，观察到PI3K-Akt信号通路、ECM重塑和细胞因子-细胞因子受体相互作用相关基因在OV.CAF特征高表达组中均呈上调趋势。这些发现表明OV.CAF特征可能代表卵巢癌中的CAF浸润，并可作为预后生物标志物。

图5 卵巢癌相关成纤维细胞(OV.CAF特征)基因表达特征与三个公共临床数据集中患者预后的关联性

全文总结

本研究成功构建了包含CAFs的卵巢癌类器官培养模型，复制了肿瘤细胞与CAFs之间的相互作用。研究发现CAFs可能通过涉及PI3K-Akt信号级联、细胞因子-细胞因子受体相互作用和ECM-受体相互作用的多重通路促进类器官生长和耐药性的发生。这为肿瘤研究提供了TME相互作用的临床前模型，特别是在靶向治疗和免疫治疗的背景下，为指导治疗决策提供了重要参考。该模型不仅为阐明卵巢癌耐药机制提供了可靠的研究平台，也为开发针对性治疗策略奠定了基础。研究结果强调了靶向PI3K-Akt信号通路的治疗潜力，特别是通过抑制CAFs与肿瘤细胞之间关键配体和受体的串扰来破坏这种相互作用。