大麻二酚及其代谢物对睾丸 Leydig 细胞的毒性机制研究

大麻二酚(CBD)作为大麻植物的主要成分，已被批准用于治疗癫痫等疾病，但其潜在的男性生殖毒性一直是研究热点。近期《Archives of Toxicology》发表的研究首次系统比较了 CBD 及其主要代谢物在小鼠 TM3 Leydig 细胞和原代人 Leydig 细胞中的毒性效应，发现 CBD 及其代谢物可通过诱导细胞周期阻滞、DNA 合成抑制和凋亡，损伤 Leydig 细胞功能，且跨物种的分子机制高度保守。这一发现为评估 CBD 的男性生殖风险提供了关键依据，也为相关药物安全性评价提供了新的体外模型。

本研究探讨了 CBD 及其代谢物 7 - 羟基 - CBD 和 7 - 羧基 - CBD 对 TM3 小鼠 Leydig 细胞的毒性作用，并与原代人 Leydig 细胞进行对比。结果显示，CBD 在 30 µM 以下即可降低细胞活力、诱导 G1 期阻滞及 DNA 合成抑制，高浓度(≥50 µM)或长期(20 µM/6 天)暴露可诱导凋亡。两种代谢物表现出类似毒性效应。转录组测序分析表明，线粒体功能障碍、氧化应激和自噬是两种细胞共有的主要富集通路。该研究证实 CBD 及其代谢物在跨物种 Leydig 细胞中具有可比的毒性效应及作用机制，为 CBD 的生殖毒性研究提供了重要参考。

研究背景

大麻二酚(CBD)作为大麻植物的主要成分，已被批准用于治疗癫痫等疾病，但其潜在的男性生殖毒性备受关注。动物实验表明，CBD 可导致睾丸萎缩、精子生成抑制及睾酮水平下降，但具体机制尚不明确。Leydig 细胞作为睾丸间质中负责睾酮分泌的关键细胞，其功能异常可能是 CBD 致生殖毒性的重要环节。此前研究发现 CBD 可诱导原代人 Leydig 细胞凋亡，而本研究聚焦于 CBD 及其主要代谢物 7 - 羟基 - CBD 和 7 - 羧基 - CBD 在 TM3 小鼠 Leydig 细胞中的毒性效应，并通过转录组分析比较跨物种的分子机制差异，以填补当前对 CBD 代谢物毒性及作用通路认知的空白。

实验结果

Figure 1：CBD 对 TM3 细胞的急性毒性及细胞周期调控

CBD(10–55 µM)处理 TM3 细胞 24 小时后，细胞活力呈浓度依赖性降低，BMD50 为 29.7 µM，同时 LDH 释放增加，表明细胞膜损伤。20 µM CBD 可导致 F - 肌动蛋白聚集，破坏细胞骨架完整性，可能干扰细胞分裂进程。30 µM CBD 使 G1 期细胞比例从 46.7% 升至 56.8%，S 期细胞减少，伴随细胞周期蛋白 D1、E2 及 CDK2/4 蛋白表达下调，证实 G1 期阻滞机制。EdU 掺入实验显示，20–30 µM CBD 使 S 期细胞比例降低 13.0%–27.9%，进一步验证 DNA 合成抑制效应。

Figure 2：CBD 代谢物的细胞毒性及 DNA 合成抑制作用

7 - 羟基 - CBD(10–55 µM)和 7 - 羧基 - CBD(40–200 µM)处理 24 小时后，BMD50 分别为 35.3 µM 和 95.8 µM，其中 7 - 羟基 - CBD 毒性与 CBD 相近，7 - 羧基 - CBD 毒性较弱。70 µM 7 - 羧基 - CBD 和 30 µM 7 - 羟基 - CBD 分别使 EdU 阳性细胞比例降至 44.7% 和 4.1%，表明两种代谢物均可抑制 DNA 合成，且作用模式与 CBD 类似。

Figure 3：CBD 及其代谢物诱导 TM3 细胞凋亡

60 µM CBD、60 µM 7 - 羟基 - CBD 或 200 µM 7 - 羧基 - CBD 处理 24 小时，早期及晚期凋亡细胞比例分别增至 49.9%、20% 和 10.7%。长期暴露实验中，30 µM CBD 处理 6 天导致细胞增殖停滞，凋亡细胞比例达 38.3%，且 20–30 µM CBD 的凋亡诱导效应呈浓度和时间依赖性。

Figure 4：跨物种细胞摄取差异及毒性相关性

质谱分析显示，15 µM CBD 处理 24 小时后，原代人 Leydig 细胞内 CBD 含量(155.0 ng/10⁶细胞)高于 TM3 细胞(110.4 ng/10⁶细胞)，7 - 羟基 - CBD 和 7 - 羧基 - CBD 的摄取量在人细胞中也显著更高。7 - 羧基 - CBD 在两种细胞中摄取量最低(人细胞 4.7 ng/10⁶细胞，TM3 细胞 1.3 ng/10⁶细胞)，与其低毒性特征一致，提示细胞摄取量可能影响毒性差异。

Figure 5：转录组分析揭示保守的毒性信号通路

mRNA 测序显示，CBD 处理后，人 Leydig 细胞中 2400–3300 个基因差异表达，小鼠 TM3 细胞中 1200–2300 个，其中 1127 个基因为两者共有，主要富集于细胞分裂、DNA 复制等通路。IPA 分析显示，CLEAR 信号通路、NRF2 介导的氧化应激反应和自噬通路在两种细胞中均上调，而线粒体氧化磷酸化通路下调，提示能量代谢紊乱可能是毒性机制之一。

Figure 6：凋亡相关基因的跨物种一致性调控

凋亡 Z 评分显示，人细胞中凋亡通路持续激活(Z>2)，小鼠细胞在第 1、3、4 天 Z>2，证实凋亡通路激活。共有的凋亡相关基因如 BBC3(PUMA)、ATF3 在两种细胞中均上调，其中 PUMA 作为 p53 下游基因，可激活线粒体凋亡途径，与 Western blot 结果一致，表明跨物种凋亡机制的保守性。

Figure 7：IPA 分析揭示 CBD 处理后保守的信号通路及上游调控因子

通过 IPA 对比分析 CBD 处理后 5 天内的转录组数据，发现人和小鼠 Leydig 细胞中重叠的前 15 条经典通路，如 CLEAR 信号通路、NRF2 介导的氧化应激反应和自噬通路均显著上调，而线粒体氧化磷酸化、细胞周期调控等通路下调。其中，CLEAR 信号通路响应细胞应激，NRF2 通路调控抗氧化反应，两者的激活提示细胞对 CBD 毒性的防御机制;而线粒体功能下调可能导致能量代谢紊乱，促进细胞凋亡。上游调控因子预测显示，NUPR1 和 TP53(p53)在两种细胞中均为关键调控因子，p53 的 Z 评分随时间递增，与先前发现的 p53 参与 CBD 诱导的细胞毒性一致。此外，人细胞中干扰素信号通路和未折叠蛋白反应(UPR)上调，而小鼠细胞中这些通路下调，提示种属间存在部分通路差异。

Figure 8：转录组分析验证 CBD 诱导的凋亡通路激活

IPA 分析显示，CBD 处理后，人 Leydig 细胞的凋亡 Z 评分持续 > 2(P<0.05)，小鼠 TM3 细胞在第 1、3、4 天 Z>2，证实凋亡通路的显著激活。进一步分析凋亡相关基因表达发现，BBC3(PUMA)、ATF3 等关键基因在两种细胞中均上调。PUMA 作为 p53 下游的促凋亡蛋白，可激活线粒体凋亡途径;ATF3 作为应激响应转录因子，参与 DNA 损伤和内质网应激诱导的凋亡。热图分析显示，人细胞中 25 个凋亡相关基因(如 EDA2R、KLF4)和小鼠细胞中 19 个基因(如 LCN2、PTGDS)的表达模式高度一致，且多数基因在 CBD 处理后呈时间依赖性上调，支持跨物种凋亡机制的保守性。

实验结论

本研究证实，CBD 及其代谢物 7 - 羟基 - CBD 和 7 - 羧基 - CBD 对 TM3 小鼠 Leydig 细胞具有浓度依赖性毒性：低浓度 CBD(<30 µM)可降低细胞活力、诱导 G1 期细胞周期阻滞并抑制 DNA 合成，高浓度(≥50 µM)或长期低浓度(20 µM/6 天)暴露可诱导细胞凋亡。两种代谢物表现出与 CBD 相似的毒性模式，其中 7 - 羟基 - CBD 毒性与 CBD 相当，7 - 羧基 - CBD 毒性较弱。转录组分析显示，CBD 处理后，人和小鼠 Leydig 细胞均富集线粒体功能障碍、氧化应激和自噬通路，p53 信号通路激活是诱导凋亡的共同机制，证实跨物种毒性机制的保守性。