人多能干细胞来源的人肝芽类器官中窦状血管的自组织

器官特异性血管系统在器官发育和再生过程中发挥着至关重要的作用，通过直接和间接的相互作用来指导实质细胞系的分化，而不仅仅是建立被动的循环通道。肝脏特异性毛细血管丛由肝窦内皮细胞(LSECs)组成，这些细胞在形态学上具有独特性，具有最小的基底膜和窗孔，促进窦状隙与肝实质之间的液体交换。LSECs是体内最强大的清道夫系统之一，配备有各种清道夫受体和强大的内吞能力。

尽管之前的研究已经使用人诱导多能干细胞(hiPS细胞)衍生的内皮细胞生成了血管化肝类器官培养物，但所产生的内皮细胞表达动脉标记物，未能获得LSEC特征。最近，几种定向分化方案从PSC衍生的血管母细胞生成了祖细胞，这些祖细胞可以移植并在单克罗塔林诱导的预处理后成熟为LSEC特征。然而，这些肝脏特异性内皮细胞在人类器官类器官中的自组织仍然是一个重大挑战。

肝窦内皮细胞还与一个重要的临床问题相关——血友病A，因为LSECs是产生凝血因子VIII(FVIII)的主要细胞类型。目前血友病A的标准治疗方法是重复静脉输注重组人FVIII蛋白，但这种治疗方法存在成本高、需要频繁给药以及可能产生抗体等问题。因此，开发能够持续产生功能性凝血因子的新型治疗方法具有重要意义。

近期，发布在nature biomedical engineering期刊，题为Self-organization of sinusoidal vessels in pluripotent stem cell-derived human liver bud organoids的研究主要目标是：在肝脏血管发育过程中纵向单细胞转录组的指导下，建立肝窦内皮细胞祖细胞的分步分化方案;构建允许具有关键器官特异性功能特征的肝脏与内皮亚群自我组织的三维(3D)类器官培养体系;阐明多细胞类器官发育过程中发生的细胞间信号串扰;并评估这些血管化类器官产生的凝血因子能否在动物和人类模型中修复凝血因子缺乏症。

研究结果

1，肝窦内皮祖细胞的定向分化

研究团队建立了从人诱导多能干细胞向肝窦内皮祖细胞(iLSEP)的逐步分化方案。该方案基于发育过程中连接胚胎和胚胎外组织(卵黄囊)的卵黄静脉分支延伸至隔膜横膈，随后经历原始静脉丛重塑的生物学过程。通过应用2D微图案化分化方法诱导包括原条和卵黄囊区域在内的中胚层祖细胞，然后应用已发表的造血母细胞分化方案获得卵黄囊样内皮特征。流式细胞术分析显示，分选的第8天CD34+细胞与CD31和CD32共表达达到88±0.7%的纯度。

2，转录组学指导的LSEC分化

为了捕获LSEC命运获得过程中发生的关键转录变化，研究团队整合了成人肝脏、胎肝、卵黄囊和胎心的单细胞基因表达谱。伪时间重建分析证实了卵黄囊和心内膜标记物的减少以及LSEC标记物根据发育阶段的增加。通路富集分析显示，在胎儿LSEC分化过程中，血管增殖信号通路如VEGF-A、胃泌素和肿瘤抑制因子M(OSM)通路在早期激活，而补体和凝血通路在从后期发育阶段到成年阶段被上调。基于这些发现，研究团队优化了iLSEP向LSEC样细胞的分化条件，发现OSM处理能够以浓度依赖性方式显著提高CD31+、CD32+和LYVE1+窦状内皮样细胞群的纯度。

3，血管化肝类器官的自组织培养

研究团队开发了一种倒置多层气液界面3D(IMALI)培养系统，使用多孔膜过滤器结合多层技术。在此系统中，肝内胚层(iHE)、iSTM和iAEC被嵌入第一层邻近转孔插件膜，然后额外分层iLSEP或iAEC。全贴片免疫荧光染色证明，iLSEP(而非iAEC)在含有CD32b+CD31+细胞和CD32b−CD31+细胞的HLBO内形成分支3D内皮网络，与ASGR1+肝细胞簇相邻。免疫荧光分析进一步揭示了HLBO中存在中央静脉样内皮细胞亚群(THBD+vWF+LYVE1−)和窦状样内皮细胞(LYVE1+STAB1+CD32b+THBD−vWF−)。

4，体内血管重建和功能验证

为了检查体内血管网络重建能力，将HLBO植入免疫缺陷小鼠的颅窗中进行后续光学访问。重复的活体成像显示，+iLSEP HLBO在移植后6天内发育出通畅且完全灌注的血管，并进一步重塑形成功能性血管系统。通过注射两种不同分子量的荧光葡聚糖来测试器官衍生血管的通透性。结果显示，在+iLSEP HLBO移植物中，2,000 kDa葡聚糖完全被限制在重建的血管内，而70 kDa葡聚糖则渗透出血管，这与肝窦血管的生理特性一致。

图1：诱导多能干细胞衍生的肝样胆管样器官中正弦状内皮网络的自组织形成

5，凝血功能和治疗应用

HLBO产生多种凝血因子，其中+iLSEP HLBO的FVIII分泌水平显著高于+iAEC或−EC HLBO(3-5倍增加)，且FVIII产生在+iLSEP HLBO中持续增加至培养30天。活化部分凝血活酶时间(APTT)测定显示，相对于+iAEC HLBO，+iLSEP HLBO在第11天的APTT缩短了4倍，且这种效果至少持续35天。在NSI-FVIII KO小鼠模型中，HLBO衍生蛋白的静脉注射使出血停止时间明显短于当前使用重组人FVIII的标准治疗。最重要的是，原位移植的HLBO成功重建了人CD32b+血管系统并持续分泌功能性FVIII，在移植后4周和8周出血时间和血液损失都明显减少，功能性FVIII产生持续至少5个月。

图2：携带血窦的HLBO类器官中凝血因子的体外与体内功能

全文总结

本研究实现了从人多能干细胞到肝窦内皮祖细胞的定向分化，并成功构建了具有器官特异性血管系统的肝类器官。这一突破性成果为理解器官特异性血管发育的关键机制提供了重要见解，特别是WNT2介导的窦状内皮到肝细胞间的细胞间串扰在促进肝细胞分化和分支内皮网络形成中的作用。

从临床转化角度来看，该研究为血友病A等凝血障碍疾病提供了新的治疗策略。与现有的基因治疗方法相比，基于器官类器官的再生技术提供了一种产生多种凝血因子的替代方法，可能克服单一因子治疗的局限性。此外，HLBO产生的凝血因子即使在抑制剂存在的情况下也表现出更好的凝血活性，这对于20-30%产生抑制剂的严重血友病A患者具有重要意义。

该研究建立的先进器官类器官血管化技术平台，为研究控制器官特异性血管发育的关键机制铺平了道路，并为凝血障碍治疗学的发展奠定了基础。这一技术有望推动器官类器官技术向更高复杂性和功能性方向发展，为再生医学领域带来新的机遇。