人类心脏类器官的成熟化促进复杂疾病建模和药物发现

人类多能干细胞(hPS)衍生的心肌细胞在疾病建模和药物筛选方面具有巨大潜力，但其不成熟的表型严重限制了应用效果。现有的心肌细胞培养系统通常表现出胚胎期特征，包括自发收缩率高、代谢不成熟、肌节蛋白异构体表达不完全等问题。尽管研究人员尝试了多种成熟化策略，如机械负荷、电刺激、代谢转换和激素刺激等，但这些方法往往效果有限，无法充分重现成人心脏的生理特性。

现有的心脏类器官(hCOs)制备技术虽然在一定程度上改善了心肌细胞的成熟度，但仍存在关键局限性。传统的血清游离心脏类器官(SF-hCOs)协议虽然通过代谢成熟化阶段提升了细胞功能，但成熟标志物如心肌肌钙蛋白I(TNNI3)的表达水平仍然很低，相当于约20周胎儿心脏的水平。这种不成熟状态导致药物反应不准确、疾病表型不明显，严重影响了其在药物开发和疾病研究中的可靠性。因此，迫切需要开发更有效的成熟化策略，以产生更接近成人心脏特征的功能性心脏类器官模型。

近期，发布在Nature cardiovascular research期刊，题为Maturation of human cardiac organoids enables complex disease modeling and drug discovery的研究确立了DM-hCOs作为心脏生物学、疾病和药物筛选应用的多功能平台。

研究结果

1，AMPK和ERR激动剂驱动心脏类器官成熟化

研究团队基于人类心脏成熟化的转录特征，系统筛选了能够促进心脏类器官成熟的药理学因子。通过组合筛选发现，10 μM MK8722(AMPK激活剂)与3 μM DY131(ERRβ/γ激动剂)的联合使用能够显著提升心肌细胞成熟度。这种定向成熟化(DM)处理在培养的第24-28天短暂应用4天，能够持续降低自发收缩频率，同时显著增加成熟心肌肌钙蛋白I(cTnI)的表达。值得注意的是，急性DM处理与电刺激激活了相似的磷酸化信号网络，其中48.2%的差异调节磷酸位点重叠，表明两种刺激通过相似的分子机制促进心肌成熟。蛋白质组学分析显示，DM处理主要上调代谢相关蛋白的表达，这与心脏成熟过程中的代谢变化一致。

图1筛选促进人类心脏器官成熟的组合刺激方案

2，DM-hCOs展现增强的肌节和代谢成熟特征

单细胞RNA测序分析显示，DM-hCOs在心肌细胞群体中表现出显著的转录变化，占所有差异表达基因的59%。在心肌细胞亚群中，成熟标志基因如TNNI3和MYL2的表达明显上调，同时转录调节因子FOXP1、SOX6和CSRP3等心脏发育关键基因也显著增加。特别是在心肌细胞cluster 3中，上调的基因主要富集于氧化磷酸化相关的基因本体术语，包括直接的ERRα/ERRγ靶基因，涉及线粒体电子传递和ATP合成。实时监测显示，DM-hCOs的最大呼吸能力显著高于SF-hCOs，证明了其增强的代谢成熟度。空间转录组学分析进一步确认，成熟标志物在DM-hCOs中呈现均匀分布，表明成熟化过程的同质性。

图2 DM-hCOs中的肌节与代谢成熟过程

3，DM-hCOs具备复杂的细胞间相互作用和功能特性

共聚类分析显示，SF-hCOs和DM-hCOs均包含与人体心脏相似的多种细胞类型，包括心肌细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和心外膜细胞。TCF21谱系追踪实验证实，心脏类器官含有来源于心外膜的成纤维细胞群体，这些细胞在hCOs表面和内部均有分布。DM-hCOs中心肌细胞亚型分析显示其具有左心室特征，表达心室标志物IRX4和左心室标志物TBX5，而缺乏右心室/流出道标志物ISL1的表达。内皮细胞亚群主要表现为心内膜特征，高表达NRG1、NFATC1和GATA4，而冠状动脉标志物APLN和FABP4表达较低。此外，研究发现hCOs能够通过内源性旁分泌因子维持细胞群体，心肌细胞和平滑肌细胞表达FGF2、FGF10和VEGFA，支持成纤维细胞和内皮细胞的增殖和存活。

4，自发收缩活动的多因素调控机制

DM-hCOs表现出显著降低的自发收缩频率，这一特征通过多种机制实现。使用1 μM cilobradine阻断funny电流(If)后，DM-hCOs表现出更稳定的静息状态，而SF-hCOs仍表现出"爆发"式活动。功能性肌浆网的建立是DM-hCOs的重要特征，静息后增强实验显示DM-hCOs的首次收缩力增加36%，与人类心脏的43%相近。使用25 μM雷诺定阻断RyR2后，DM-hCOs的收缩频率下降15%，明显高于SF-hCOs的6%，表明肌浆网钙释放在调节收缩频率中发挥更重要作用。基因表达分析显示，DM-hCOs中PLN表达增加、CACNA1D下调(同时CACNA1C上调)以及GJA1表达增加，这些变化共同促成了频率的降低和收缩稳定性的提高。

图3 SF-hCOs与DM-hCOs中的速率调控机制及肌浆网处理机制

5，准确预测心脏活性药物的药理反应

DM-hCOs在药物筛选方面展现出优异的性能。使用12种CiPA化合物进行测试，Tr50是预测心律失常风险最可靠的参数，所有高风险化合物在接近Cmax浓度时使Tr50增加32-64%。低风险化合物如雷诺嗪、美西律、地尔硫卓和维拉帕米即使在超生理浓度下也不增加Tr50。对于17种不同作用机制的心脏活性化合物，DM-hCOs能够准确区分正性和负性肌力药物。值得注意的是，比较奥美卡韦和达尼卡韦这两种肌球蛋白激活剂在临床血清浓度下的表现，达尼卡韦在增加收缩力的同时对收缩持续时间的影响较小，显示了DM-hCOs在药物安全性评估中的价值。

6，DSP心肌病的疾病建模和治疗药物发现

利用来源于DSP基因突变患者的诱导多能干细胞，研究团队成功建立了DSP心肌病模型，DSPmut DM-hCOs表现出Tr50增加30%，提示舒张功能障碍。病理学检查显示DSPmut hCOs中DSP表达缺失、CX43定位异常以及肌节结构紊乱。蛋白质组学分析揭示了广泛的蛋白表达谱改变，涉及细胞外基质、代谢调节因子、离子通道调节因子等多个生物学过程。药物筛选发现，溴结构域和超末端蛋白抑制剂INCB054329能够完全逆转DSPmut DM-hCOs的舒张功能缺陷，其机制可能与恢复MYH6表达有关，因为在DSP突变的人类心脏活检样本中MYH6表达下降28-166倍。这一发现为DSP心肌病提供了潜在的治疗策略。

图4 构建DSP心肌病模型并在DM-hCOs中筛选候选治疗药物

全文总结

本研究建立的定向成熟化心脏类器官(DM-hCOs)平台代表了心脏疾病建模和药物发现领域的重要技术突破。该平台通过模拟人类心脏成熟的关键信号通路，显著提升了hPS细胞衍生心肌细胞的成熟度，使其更接近成人心脏的生理特征。DM-hCOs在药物安全性评估方面表现出色，能够准确识别具有心律失常风险的化合物，为药物开发过程中的心脏毒性筛选提供了可靠工具。

更重要的是，DM-hCOs成功应用于遗传性心肌病的疾病建模，不仅重现了疾病表型，还发现了潜在的治疗药物，证明了其在精准医学和个体化治疗方面的巨大潜力。该平台的建立为心血管疾病的机制研究、药物开发和治疗策略优化提供了强有力的技术支撑，有望加速心血管疾病治疗方法的开发进程。