基于水凝胶的GelMA-HAMA支架支持GBM类器官克隆生长用于药物筛选

成人胶质母细胞瘤(GBM)是一种高度恶性的弥漫性胶质瘤，代表了最具侵袭性的脑肿瘤类型之一，其特征是预后极差和治疗效果有限。GBM具有强烈的瘤间和瘤内异质性，这一特征显著促进了其治疗抗性并带来了临床管理挑战。胶质母细胞瘤干细胞(GSCs)被广泛认为是GBM发生和进展的主要原因。GBM肿瘤的生长本质上依赖于三维(3D)体内环境，传统的二维(2D)细胞培养模型无法捕获GBM生物学的复杂性。近年来，类器官技术已成为一种有前景的方法，为GBM研究提供了新的机会和见解。

以往研究主要采用小鼠来源的Matrigel构建GBM类器官，然而Matrigel主要由层粘连蛋白组成，为上皮肿瘤的生长创造了更有利的环境。相比之下，大脑的天然细胞外基质富含透明质酸(HA)和蛋白聚糖。因此，Matrigel提供的环境并不适合大脑的生理条件，其生化和生物物理特性与大脑细胞外基质存在较大差异。此外，Matrigel具有相当大的批次间变异性，严重影响实验结果的一致性和重现性。水凝胶是亲水性聚合物，具有透明质酸、海藻酸、明胶和纤维蛋白等标准材料。由于其生物相容性、可降解性、无毒性、成本效益、高可获得性和易于修饰等特点，这些材料在组织工程、再生医学和化妆品应用中得到广泛应用。

近期，上海大学附属罗店医院的研究人员在Cell Transplantation期刊发布了题为Optimizing GBM organoid construction with hydrogel-based models:GelMA-HAMA scaffold supports GBM organoids with clonal growth for drug screening的研究，该研究筛选并测试了几种常用于构建胶质母细胞瘤类器官的水凝胶材料——甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)、甲基丙烯酰化壳聚糖(CSMA)和甲基丙烯酰化明胶(GelMA)。

研究结果

1，GSCs的培养和表征及2D微环境刚度的影响

研究首先对用于构建类器官的GSCs进行了表征。培养的GSCs呈现典型的纺锤形形态，处于高度增殖状态。免疫荧光分析确认GSCs身份，对GSCs标志物CD133、SOX2和Nestin呈阳性表达，超过90%的细胞为Ki67阳性，表明GSCs具有高增殖能力。为了研究刚度对GSCs的影响，研究者测试了不同浓度的HAMA、GelMA和CSMA在其适用范围内的储存模量，结果显示所有三种材料的储存模量随浓度升高而显著增加。在2D培养中，不同材料对GSCs生长产生不同影响：Matrigel组的细胞贴壁增殖，HAMA种子细胞保持分散状态呈圆形而不贴壁，GelMA组少数细胞贴壁但大多数悬浮分散，CSMA组表现出独特的聚集模式且不贴壁。当提高材料浓度时，HAMA和GelMA组都表现出明显的团簇形成趋势。

图1 胶质瘤干细胞(GSCs)的培养与特性表征

2，Matrigel与HAMA混合(MH)诱导GSCs形成克隆状态

为了优化GBM的培养条件，研究者将水凝胶材料与Matrigel整合，构建了三种混合模型：Matrigel与CSMA混合(MC)、Matrigel与GelMA混合(MG)和Matrigel与HAMA混合(MH)。流变学分析显示，储存模量与CSMA浓度呈正相关，与GelMA浓度呈负相关，而HAMA的储存模量变化不呈线性趋势。最终选择了1:2的混合比例。在长期培养观察中，Matrigel中的细胞容易扩散和增殖，呈现纺锤样形态并主动向彼此迁移;而MH和MC中的细胞很少扩散和迁移，通过积极增殖在基质内形成均匀分布的球形结构，称为"克隆"。MG组由于Matrigel和GelMA的不均匀混合未能形成任何均匀结构。进一步优化MH模型时，比较了不同分子量(150 kDa、300 kDa和400 kDa)的HAMA，发现300 kDa组形成了分布均匀的球形克隆，而其他组主要聚集在中心且分布不均。

3，GelMA-HAMA(GH) 1:2混合物形成均匀球形克隆

为了开发更具成本效益且重现性高的基质支架，研究者探索了通过将CSMA和GelMA与HAMA以不同比例混合的新支架策略。CSMA与HAMA的混合在所有测试比例中都没有产生令人满意的结果，GSCs的增殖相当有限。相比之下，GelMA与HAMA混合良好，在不同混合比例下都支持细胞快速增殖。特别是在1:2比例下，GH支架支持形成明确定义的球形克隆，其特征是增殖旺盛、丝状细胞较少、球形结构比其他模型更大。溶胀率测试表明，纯GelMA的溶胀率高，而纯HAMA的溶胀率低，以三种不同比例混合两者显著平衡了溶胀率。免疫荧光染色显示MH和GH 1:2模型都保持了GSCs的特征并再现了肿瘤增殖异质性，但GH 1:2 GBM模型产生了更均匀的球形克隆。

图2 构建与表征Matrigel-水凝胶混合模型

4，GelMA-HAMA(GH) GBM模型用于药物筛选

为了评估GH模型在药物筛选中的潜力，研究者选择了两种药物组合——CX5461和CX5461+IFNβ进行测试。CX5461是一种G-四联体稳定剂，能有效靶向GBM;IFNβ是一种免疫调节因子，已被证明能靶向肿瘤微环境。对培养33天形成大量球形克隆的GH模型类器官给予药物处理。治疗的前3天两种治疗方案之间无显著差异，但治疗13天后，联合治疗组显示球形克隆大小明显减少。第30天时，联合治疗组表现出克隆数量的显著减少，而单药治疗组变化很少。Ki67和凋亡标志物Cleaved Caspase-3(C-Cas3)的评估显示，CX5461单药治疗组Ki67表达仍然很高，C-Cas3表达最少;相比之下，联合治疗组Ki67阳性细胞显著减少，C-Cas3阳性细胞增加，表明GSCs增殖减少和凋亡启动。这些分析证实了GH模型可用于GBM药物测试和筛选。

图3 GH GBM类器官药物细胞毒性检测

全文总结

本研究成功开发了一种基于GelMA和HAMA适当组合的新型、具有成本效益且可重现的胶质母细胞瘤类器官构建策略。该系统能够再现GBM的关键特征，可有效应用于GBM建模和药物筛选。GH复合材料的组成明确定义，不含动物来源的Matrigel，具有改善的实验稳定性和重现性，同时显著降低了相对于Matrigel的实验成本。这一创新方法为胶质母细胞瘤的精准医疗研究提供了重要的技术平台，有望加速新型抗癌药物的发现和开发。该模型能够捕获瘤内异质性，为理解GBM的复杂生物学特性和开发个性化治疗策略奠定了基础。