自然杀伤细胞对克氏锥虫感染的人原代角质形成细胞的抗菌活性研究

南美锥虫病(Chagas disease)作为全球最被忽视的热带疾病之一，由克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)感染引起，其感染初始阶段与皮肤免疫反应密切相关。近期《PLOS Neglected Tropical Diseases》发表的研究首次构建了克氏锥虫感染人原代角质形成细胞(hPEK)的体外模型，发现自然杀伤细胞(NK 细胞)可通过识别感染细胞并释放细胞毒性分子，有效控制寄生虫增殖。该研究揭示了皮肤免疫在 Chagas 病早期防御中的关键作用，为开发针对病原体皮肤入侵的干预策略提供了新思路。

研究背景

Chagas 病在拉丁美洲影响约 600–700 万人，克氏锥虫通过昆虫叮咬侵入皮肤，而角质形成细胞作为表皮主要细胞类型，既是感染初始靶点，也可能成为慢性感染的寄生虫储存库。既往研究发现，NK 细胞在克氏锥虫感染早期发挥关键防御作用，但其与皮肤上皮细胞的相互作用机制尚不明确。此外，角质形成细胞在感染后如何调节 NK 细胞激活信号，以及 IFN-γ 等细胞因子在其中的作用，仍是领域内的研究空白。本研究通过构建自体共培养模型，首次系统解析了 NK 细胞对感染角质形成细胞的应答模式，为阐明皮肤免疫在 Chagas 病中的作用提供了新视角。

实验结果

Figure 1：克氏锥虫对人原代角质形成细胞的感染动力学

免疫荧光染色显示，克氏锥虫 Brazil 株以 MOI 3:1 感染 hPEK 后，24 小时可见单个胞内无鞭毛体，72 小时感染细胞内无鞭毛体数量显著增多，96 小时可见向血液型锥鞭毛体转化。高内涵筛选(Opera Phenix)定量分析显示，Brazil 株感染效率显著高于 Tulahuen 株，MOI 6:1 时感染率达 25%，平均每感染细胞含 2.5–3.6 个寄生虫，而 Tulahuen 株感染率仅 3%，提示不同株系感染能力存在差异。该结果证实 hPEK 可作为研究克氏锥虫皮肤感染的合适模型。

Figure 2：NK 细胞对感染角质形成细胞的活化反应

流式细胞术分析显示，与感染 hPEK 共培养后，NK 细胞 CD107a 阳性率从 7.5% 升至 24.1%，CD16 表达下调 10.8%，提示 NK 细胞活化。多重珠式免疫测定显示，共培养上清中 IL-6(2.8 倍)、IFN-γ(3.2 倍)和 Granzyme A(1.9 倍)水平显著升高，证实 NK 细胞通过分泌促炎因子和细胞毒性分子发挥防御作用。该结果表明感染角质形成细胞可直接激活 NK 细胞，启动局部免疫应答。

Figure 3：NK 细胞对感染角质形成细胞的细胞毒性效应

Opera Phenix 系统定量分析显示，效应细胞与靶细胞比例(E:T)为 10:1 时，NK 细胞可使感染细胞比例降低 37.2%，每感染细胞寄生虫数量减少 41.8%。细胞计数分析证实，NK 细胞通过直接杀伤感染细胞降低寄生虫负荷，且该效应呈 E:T 比例依赖性。结果表明 NK 细胞不仅通过细胞因子间接抑制寄生虫，还能直接清除感染细胞，发挥双重防御功能。

Figure 4：IFN-γ 刺激对角质形成细胞免疫分子表达的调控

流式细胞术显示，10 ng/ml IFN-γ 刺激 72 小时后，hPEK 表面 HLA-DR(98.7%)、ICAM-1(95.3%)、PD-L1(92.1%)及 PD-L2(89.6%)表达接近 100%，HLA-ABC、MIC-A/B 等分子也显著上调。低浓度 IFN-γ(0.1 ng/ml)即可诱导 HLA-DR(19.6%)和 ICAM-1(51%)表达，而克氏锥虫感染仅显著诱导 PD-L1/PD-L2 表达。该结果表明 IFN-γ 通过重塑角质形成细胞免疫微环境，增强其与 NK 细胞的信号交互。

Figure 5：免疫调节分子在 NK 细胞活化中的协同作用

IPA 通路分析显示，IFN-γ 刺激显著富集 CLEAR 信号通路、NRF2 氧化应激反应及自噬通路，而克氏锥虫感染单独作用较弱。表面分子表达谱显示，IFN-γ 诱导的 ICAM-1 和 HLA-DR 可增强 NK 细胞黏附和抗原识别，而 PD-L1/PD-L2 的上调可能兼具免疫激活与抑制双重功能。该结果揭示 IFN-γ 通过协同调控激活与抑制性配体，精细调节 NK 细胞的抗菌活性。

实验结论

克氏锥虫可高效感染人原代角质形成细胞，感染后 NK 细胞通过 CD107a 脱颗粒、细胞因子释放及直接细胞毒性发挥抗菌作用。IFN-γ 刺激显著上调角质形成细胞表面 HLA 分子、PD-L1/PD-L2 及 ICAM-1 等免疫调节分子，增强 NK 细胞识别效率。感染早期 NK 细胞的激活不依赖经典激活配体的显著变化，但 IFN-γ 可通过重塑细胞表面分子景观强化免疫监视。该研究证实角质形成细胞作为 “哨兵细胞”，通过与 NK 细胞的动态互作，在皮肤局部建立针对克氏锥虫的第一道免疫防线。