基于生物启发的外切体-SiO2纳米复合疗法类风湿性关节炎治疗。

基本信息

英文标题：Bioinspired exosome-SiO₂ nanohybrid therapeutic for rheumatoid arthritis treatment

中文标题：基于生物启发的外切体-SiO2纳米复合疗法类风湿性关节炎治疗。

发表期刊：《Theranostics》

影响因子：13.3

作者单位：安徽医科大学第一附属医院风湿免疫科、安徽医科大学第二附属医院风湿免疫科、安徽省炎症与免疫介导疾病实验室、南京大学医学院附属鼓楼医院转化医学研究所

作者信息：

Qicui Zhu, Ruofei Chen, Xueting Wu, Yuanyuan Zhou, Zexin Wang, Huaixuan Zhang, Haofang Zhu, Lingyun Sun, Zongwen Shuai

研究背景

类风湿性关节炎(RA)的挑战

RA是一种慢性自身免疫性疾病，以关节破坏、滑膜增生和骨侵蚀为特征，现有治疗药物(如甲氨蝶呤MTX)存在溶解性差、非特异性分布和全身毒性等问题。

纳米载体可改善药物靶向性，但面临生物相容性差、代谢快等局限。

外泌体的优势

脂肪间充质干细胞衍生的外泌体(ADSC-EXO)具有天然免疫调节能力、低免疫原性和炎症靶向性，但作为药物载体的潜力尚未充分探索。

研究创新点

首次将介孔二氧化硅(SiO₂)负载MTX与ADSC-EXO结合，构建仿生纳米杂化系统(AE@SiO₂-MTX)，实现协同抗炎和靶向递送。

揭示该系统通过调控巨噬细胞极化(M1→M2)和抑制滑膜成纤维细胞(FLS)迁移的双重机制缓解RA。

研究方法

纳米系统构建

通过静电吸附将MTX载入SiO₂(SiO₂-MTX)，超声融合ADSC-EXO形成AE@SiO₂-MTX。

动态光散射(DLS)、透射电镜(TEM)表征粒径和形貌，Western blot验证外泌体标志物(CD81、TSG101)。

体外实验

巨噬细胞极化： 流式细胞术检测M1(CD86/iNOS)和M2(CD206)表型。

FLS迁移侵袭： Transwell和小室划痕实验评估纳米系统对FLS行为的抑制。

ROS清除： DCFH-DA荧光探针检测活性氧水平。

体内实验

关节炎模型： 佐剂诱导关节炎(AIA)和胶原诱导关节炎(CIA)小鼠模型。

靶向性验证： 近红外荧光成像(NIRF)分析纳米系统在炎症关节的富集。

疗效评估： 微CT检测骨侵蚀，HE和番红O染色分析滑膜炎症及软骨破坏。

实验结果

图1：结构化纳米递送系统示意图，该系统整合了ADSC-EXO和载甲氨蝶呤的二氧化硅纳米颗粒用于类风湿关节炎治疗

(A) AE@SiO2-MTX的构建过程。

(B) 通过静脉注射使AE@SiO2-MTX特异性积聚于炎症性关节。

(C) AE@SiO2-MTX通过逆转巨噬细胞的炎症表型并减少FLS的迁移与侵袭，从而缓解类风湿关节炎症状。

图2：ADSC-EXO与AE@SiO2-MTX的表征分析

(A) 二氧化硅的透射电镜图像。

(B-C) ADSC-EXO和AE@SiO2-MTX的动态光散射分析及透射电镜图像。

(C-E) AE@SiO2-MTX共定位的共聚焦激光扫描显微镜及线轮廓分析。比例尺：10 μm。

(F) ADSC-EXO与AE@SiO2-MTX的Zeta电位分析。

(G) AE@SiO2-MTX在粒径和Zeta电位方面的稳定性，n = 3。

(H)包封于AE-MTX和AE@SiO2-MTX中的MTX释放曲线，n = 3。数据以均值±标准差表示，ns：无显著性差异。

图3：AE@SiO2-MTX促进RAW 264.7细胞在体外从M1表型向M2表型转变

(A-B) 通过共聚焦激光扫描显微镜和流式细胞仪检测M0巨噬细胞与M1巨噬细胞对游离FITC-MTX及FITC标记的AE@SiO2-MTX的摄取情况。比例尺：20 μm。

(B) 不同处理条件下M1巨噬细胞的代表性荧光图像及(D)活性氧水平定量分析。比例尺：100 μm。

(E )采用免疫荧光染色技术检测M0 (CD68，绿色)、M1 (iNOS，红色)和M2 (CD206，红色) 标志物以观察M1巨噬细胞表型变化。比例尺：20 μm。结果以均值±标准差表示，并采用单因素方差分析评估统计学显著性。***P < 0.001，****P < 0.0001。

图4：AE@SiO2-MTX抑制RA-FLS细胞体外迁移与侵袭能力

(A) 和 (B) 通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)及流式细胞仪检测FLS对FITC-MTX和FITC-AE@SiO2-MTX的摄取情况，比例尺：20 μm。

(B-D) 分别显示FLS与PBS、ADSC、EXO、MTX、AE-MTX及AE@SiO2-MTX共孵育12小时后的细胞图像及迁移面积，比例尺：100 μm。

(D-G) 分别展示FLS与PBS、ADSC、EXO、MTX、AE-MTX及AE@SiO2-MTX共孵育24小时后的细胞迁移与侵袭情况，比例尺：100 μm。数据以均值±标准差表示。统计学显著性通过单因素方差分析计算得出，每组n = 3。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。

图5：AE@SiO2-MTX在RA-FLS模型中的代谢分析

(A)差异基因统计。

(B)和(D)对AE@SiO2-MTX组与NC组中表达量最显著的前10个mRNA基因进行GO分析和(3)KEGG通路分析。

(E)AE@SiO2-MTX组与NC组差异表达基因聚类热图。BP：生物过程;CC：细胞组分;数据以均值±标准差表示。统计学显著性通过非配对t检验计算，每组n = 3。**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。

图6：AE@SiO2-MTX在CIA小鼠体内的分布及关节细胞存在情况

(A)给药4小时和24小时后，对接受MTX、EXO、AE-MTX和AE@SiO2-MTX治疗的CIA小鼠进行体内成像。

(B)显示MTX、EXO、AE-MTX和AE@SiO2-MTX治疗4小时和24小时后，CIA小鼠主要器官及爪部的荧光图像。(C)靶向区域测量结果，n = 3。

(E-E)注射DiD标记的AE@SiO2-MTX后4小时和24小时采集的小鼠关节冷冻样本。紫色：DiD;红色：成纤维细胞(波形蛋白);绿色：巨噬细胞(F4/80);蓝色：DAPI核染色。比例尺为20 μm。

I)通过线轮廓分析确认DiD与波形蛋白及F4/80的共表达及共定位。数据以均值±标准差表示。统计学显著性通过单因素方差分析计算。**P < 0.01，****P < 0.0001。

图7：静脉注射AE@SiO2-MTX缓解CIA小鼠关节炎症状

(A) 体内治疗流程示意图。

(C-D) 治疗后不同时间点足部厚度、足部体积及关节炎评分的量化分析。

(E) 各组治疗前后后肢示意图。

(F) 不同治疗组前肢、后肢及膝关节的三维微CT图像。

(G-H) 六组治疗后骨密度水平评估。

(I-J) 治疗后血浆IL-6和IL-10水平检测。数据以均值±标准差表示，采用单因素方差分析进行统计学显著性检验。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。

图8：AE@SiO2-MTX给药后的治疗效果评估

(A) 膝关节经HE和沙黄O染色，比例尺：100 μm。

(B) 膝关节切片的TNF-α、IL-6、MMP3和MMP13及DAPI染色结果。

(C) 线形分析验证了TNF-α与IL-6、MMP3和MMP13的共表达及共定位。比例尺：50 μm。

研究结论

1. 机制创新

提出ADSC-EXO与SiO₂-MTX的协同作用机制：外泌体提供靶向性和免疫调节，SiO₂实现药物缓释。

证实LPS激活的巨噬细胞通过糖酵解重编程增强纳米系统内化。

2. 转化意义

为RA提供无细胞治疗新策略，克服传统细胞疗法的致瘤风险。

未来方向：优化外泌体表面工程以实现骨/软骨特异性靶向。