谷胱甘肽激活的免疫纳米激动剂，精准攻克乳腺癌和胰腺癌，还能诱导长效免疫记忆

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具。逸漠生物自主研发了近200种表达Fluc的细胞系，均经过荧光素酶活性检测验证，可满足科研人员的多样化需求，欢迎咨询。

基本信息

英文标题：GSH-activable and cytolytic iPep-coupled immune nanoagonist for cancer synergetic therapy

中文标题：谷胱甘肽激活的溶细胞 iPep 偶联免疫纳米激动剂用于癌症协同治疗

发表期刊：《Biomaterials》

影响因子：12.9

作者单位：

1. Department of Anesthesiology, The Second Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou, China

2. Nanobiomedicine Division, Suzhou Institute of Nano-Tech and Nano-Bionics, Chinese Academy of Sciences, Suzhou, China

3. Key Laboratory of Nano-Bio Interface, Chinese Academy of Sciences, Suzhou, China

作者信息：

Shuangshuang Ji, Xiangxiang Xu, Ang Li

研究背景

将溶瘤性免疫原性细胞死亡(ICD)诱导剂与 Toll 样受体(TLR)激动剂结合的 chemo - 免疫疗法是癌症治疗的重要方向，但两者协同机制尚未明确。TLR7/8 激动剂(如 Resiquimod，R848)存在脱靶系统性炎症风险。本研究通过谷胱甘肽(GSH)激活的连接子将 R848 与人体血清白蛋白(HSA)共价偶联，构建 R848-HSA 偶联物(RS-HSA)，再与溶膜肽 iPep 组装成 iP-RS 纳米颗粒(iP-RS NPs)。该纳米系统可减少毒性，通过 iPep 诱导溶瘤性细胞死亡、R848 激活免疫应答，协同重塑肿瘤微环境，在多种肿瘤模型中实现高效治疗。

研究方法

实验中合成了一系列谷胱甘肽(GSH)激活的 Resiquimod(R848)- 人血清白蛋白(HSA)偶联物(RS-HSA)及非激活对照(RC-HSA)，通过疏水和静电作用与溶膜肽 iPep 组装成 iP-RS/iP-RC 纳米颗粒(NPs)，利用动态光散射(DLS)、透射电镜(TEM)等表征其尺寸、形态及 GSH 响应性释放行为;以 4T1 乳腺癌、Panc02 胰腺癌、KPC 胰腺癌细胞等为模型，通过内吞途径分析、细胞死亡形态观察、免疫原性检测(ATP、HMGB1 释放及钙网蛋白暴露)评估其溶瘤及免疫激活能力，检测对树突状细胞(DCs)成熟、巨噬细胞极化的影响;建立 4T1 原位乳腺癌、Panc02 皮下胰腺癌及 fLuc-KPC 原位胰腺癌模型，通过肿瘤生长曲线、生物发光成像、流式细胞术(免疫细胞浸润)、组织染色(基质重塑)等评估体内疗效，并与传统化疗方案(吉西他滨 + 白蛋白结合型紫杉醇)对比，同时进行药代动力学、毒性及免疫记忆等相关检测。

实验结果

图1：iP-RS NP 的构建与表征

A 图展示合成流程：R848 通过 GSH 敏感连接子与 HSA 偶联(RS-HSA)，再与 iPep 组装成 iP-RS NPs，在肿瘤高 GSH 环境中释放 R848 和 iPep，协同诱导溶瘤性死亡并激活免疫;

B 图 MALDI-TOF 验证 RS-HSA 的成功偶联;

C 图 DLS 显示 iP-RS NPs 尺寸均一(约 137 nm);

D 图急性毒性实验表明 RS-HSA(1.6)安全性优于游离 R848;

E-G 图显示 RS-HSA 可剂量依赖性诱导 DCs 分泌 IL-6、TNF-α 等细胞因子;

H 图 TEM 显示 iP-RS NPs 为球形;

I 图证实其在肿瘤微环境(pH 6.5 + 高 GSH)中高效释放 R848。

结果证实 iP-RS NPs 构建成功，具有 GSH 响应性和免疫激活潜力。

图2：iP-RS NP 的细胞效应与药学性质

A 图内吞实验表明其通过能量依赖的网格蛋白介导途径进入细胞;

B 图共聚焦显示 iP-RS NPs 部分定位于溶酶体，部分分散于胞质;

C 图观察到细胞肿胀、膜破裂等溶瘤性死亡特征;

D 图 IC50 测定显示其对肿瘤细胞(4T1、Panc02 等)选择性杀伤，对免疫细胞毒性低;

E 图证实 iP-RS NPs 在细胞内释放 R848 效率显著高于非激活对照;

F-G 图显示其 supernatant 可协同促进 DC 成熟和 M2 型巨噬细胞向 M1 型极化;

H-I 图表明其血清稳定性高、溶血毒性低;

J-K 图药代动力学显示半衰期延长至 15.49 h;

L 图组织分布表明其肿瘤靶向性优于游离 iPep。

结果验证其高效靶向、溶瘤及免疫调节能力。

图3：iP-RS NP 的体内系统抗肿瘤免疫效应

A-C 图显示其可减少肿瘤中 MDSCs、Treg 比例，提高 M1/M2 巨噬细胞比值;

D 图肿瘤引流淋巴结中 DC 成熟率最高(47.20%);

E-G 图显示其显著增加肿瘤中 IFN-γ+ CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞浸润及 IFN-γ+ CD8+ T 细胞比例;

H-I 图证实其诱导肿瘤特异性 IgG 产生;

J-L 图血清细胞因子检测显示其适度激活免疫，无过度炎症。结果表明其可系统性重塑免疫微环境，增强适应性免疫应答。

图4：iP-RS NP 治愈原位乳腺癌并诱导免疫记忆

A-C 图原位 4T1 模型中，iP-RS NPs 处理组 5/5 小鼠实现肿瘤完全消退，无复发;

D 图肺转移显著减少;

E 图体重稳定，毒性低;

F 图脾脏中效应记忆 T 细胞(TEM)和中央记忆 T 细胞(TCM)比例最高;

G-H 图肿瘤再挑战实验显示治愈小鼠无肿瘤复发，生存率 100%。

结果证实其可根治乳腺癌并诱导长效免疫记忆。

图5：iP-RS NP 重塑胰腺癌微环境

A-J 图 Masson 染色、免疫组化显示其显著减少 Panc02 肿瘤中胶原纤维、α-SMA 等基质成分;

K 图肿瘤穿透实验表明其渗透深度优于传统化疗(NG);

L-R 图显示其降低 MDSCs、Treg 比例，提高 M1/M2 比值及 CD8+ T 细胞浸润。

结果证实其可破坏胰腺癌致密基质，改善免疫沙漠微环境。

图6：iP-RS NP 对胰腺癌的治疗效果

A-B 图皮下 Panc02 模型中，iP-RS NPs 处理组 5/5 小鼠肿瘤完全消退;

C-D 图直观显示肿瘤消失;

E 图体重稳定;

F 图 HE 染色显示肿瘤广泛坏死;

G-H 图原位 KPC 模型中，其使 3/5 小鼠肿瘤完全消退，生存期显著长于 NG 组(>50 天 vs <20 天)。

结果证实其对难治性胰腺癌疗效优于一线化疗。

研究结论

iP-RS NPs 通过 GSH 激活释放 R848，协同 iPep 诱导的溶瘤性细胞死亡，实现三重作用：破坏肿瘤基质、重塑免疫抑制微环境(减少 MDSCs/Treg，促进 M1 极化)、增强适应性免疫(DC 成熟、T 细胞浸润)。在原位乳腺癌、胰腺癌模型中均实现完全消退，且毒性低，可诱导长效免疫记忆，显著优于传统化疗。该系统为实体瘤的 chemo - 免疫协同治疗提供了新型纳米平台。