双区室 BRET 传感器解密 PP2A 与癌症的关联，实时捕捉蛋白互作新动态

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题：Dual compartment utility of BRET-based biosensors for PPP2R5A/B56α, a cancer-associated B regulatory subunit of PP2A

中文标题：基于 BRET 的生物传感器在 PPP2R5A/B56α(PP2A 的癌症相关 B 调节亚基)中的双区室

发表期刊：《BioTechniques》

影响因子：2.5

作者单位：

1. aDivision of Cancer RNA Research, National Cancer Center Research Institute, Tokyo, Japan

2. bDivision of Clinical Oncology and Hematology, Department of Internal Medicine, The Jikei University School of Medicine, Tokyo, Japan

3. cDepartment of Anatomy, Kyorin University School of Medicine, Tokyo, Japan

作者信息：

Hirofumi Yamauchi, Atsuro Oishi, Masahiko Ajiro

研究背景

蛋白磷酸酶 2A(PP2A)作为关键的丝氨酸 / 苏氨酸磷酸酶，在细胞调控和肿瘤抑制中起重要作用。PP2A 复合体的失调，尤其是 Aα 亚基和 B56 家族，通过改变底物相互作用(如 c-MYC 动态)与恶性肿瘤相关。由于 PP2A 底物范围广、相互作用短暂且调控机制复杂，识别其底物存在挑战。本研究构建了针对 PPP2R5A(B56α)的新型生物发光共振能量转移(BRET)传感器，可在细胞质和细胞核中实时检测蛋白质相互作用，其中核定位信号(NLS)修饰的核传感器能特异性探测 c-MYC 等核内靶标，为解析 PP2A 的调控作用及肿瘤发生机制提供了工具。

研究方法

构建 NanoLuc(Nluc)标记的 PPP2R5A/B56α 供体质粒及 YFP 标记的 PPP2R1A、PPP2CA、c-MYC 等受体质粒，部分质粒添加核定位信号(NLS)以靶向细胞核，同时构建 c-MYC 缺失突变体;HEK293T 细胞在含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素 - 链霉素的 D-MEM 中培养，采用 PEI MAX 试剂进行瞬时转染，通过 BRET 实验检测 Nluc-B56α 与 YFP 标记底物的能量转移(计算 BRET 比值并以 mBU 表示)，结合核质分离、Western blotting 验证蛋白在核质组分中的表达，利用免疫荧光和共聚焦显微镜观察亚细胞定位，通过免疫沉淀实验验证蛋白质相互作用，最后采用 unpaired t 检验或 Kruskal-Wallis 检验结合 Dunn 多重比较分析数据，使用 GraphPad Prism 10 软件绘图。

实验结果

图1：原型 B56α BRET 传感器的构建与验证

A 图展示 PP2A 复合体结构，B56α N 端标记 Nluc，A 亚基(PPP2R1A)和 C 亚基(PPP2CA)C 端标记 YFP;

B-C 图 Western blotting 证实供体和受体在全细胞及核质组分中的表达;

D 图共聚焦显示 B56α 与 PPP2R1A/PPP2CA 的共定位;

E-F 图 BRET 饱和曲线显示，Nluc-B56α 与 YFP-PPP2R1A/PPP2CA 的 BRET 信号呈饱和性(特异性相互作用)，而与 YFP-GAPDH(阴性对照)呈线性(非特异性)。

结果证实原型传感器可检测细胞质中 PP2A 亚基间的相互作用。

图2：核特异性 B56α BRET 传感器的开发

A 图共聚焦显示 B56α 主要在细胞质，c-MYC 在细胞核;

B-C 图验证核质组分中蛋白表达;D 图设计核传感器(Nluc-B56α-NLS)，通过 NLS 靶向细胞核;

E 图共聚焦显示其与核内 c-MYC 共定位，与 U2AF1(阴性对照)无共定位;

F 图 BRET 曲线显示 Nluc-B56α-NLS 与 YFP-c-MYC 的特异性相互作用(BRETmax=42.74 mBU)。

结果表明核传感器可特异性探测核内底物。

图3：c-MYC 缺失突变体与 B56α 的相互作用分析

A 图展示 c-MYC 结构(N 端激活域 NTD、酸性区 AR、核定位信号 NLS、C 端域 CTD);

B-C 图验证缺失突变体的表达及核定位;

D 图共聚焦显示各突变体均在核内;

E 图免疫沉淀证实 B56α-NLS 与 c-MYC 的结合依赖 AR 和 NLS 域;

F 图 BRET 信号显示，缺失 AR(ΔAR)或 NLS(ΔNLS)的 c-MYC 与 B56α-NLS 的相互作用显著降低。

结果明确 c-MYC 的 AR 和 NLS 域是与 B56α 结合的关键区域，验证了传感器的特异性。

研究结论

本研究成功构建了细胞质和核特异性 B56α BRET 传感器，可实时检测 PP2A B56α 与底物的相互作用：原型传感器能识别细胞质中 PP2A A/C 亚基的结合，核传感器可特异性探测核内 c-MYC 等底物，且信号强度与结合亲和力相关。c-MYC 的 AR 和 NLS 域是与 B56α 相互作用的关键。该双区室传感器为解析 PP2A 在不同亚细胞区室的调控机制提供了有力工具，有助于深入理解其在肿瘤发生中的作用，为精准治疗策略开发奠定基础。