基于光固化3D生物打印的睾丸类器官用于生殖毒性评估的体外模型

不孕症已成为21世纪第三大最常见的全球健康挑战，仅次于癌症和心血管疾病。流行病学数据显示，全球约8-12%的育龄夫妇受到不孕症影响，其中男性因素占近50%。环境污染物和药物诱导的生殖毒性，包括双酚化合物和重金属暴露，是特别值得关注的问题。传统的二维(2D)单层细胞培养无法捕获精子发生的复杂性，因为精子发生是一个严格调节的过程，依赖于由精原细胞和体细胞(包括支持细胞、间质细胞和管周肌样细胞)组成的专门精原干细胞生态位。三维(3D)器官型培养系统代表了生物建模的重大进步，通过重建关键的细胞-细胞和细胞-细胞外基质相互作用，有效解决了这些局限性。

2025年6月26日，发表在Acs Biomaterials Science & Engineering上题为Light-Based 3D Bioprinting of Testicular Organoid as an In Vitro Model for Reproductive Toxicity Assessment的研究利用光基3D生物打印技术，结合新生小鼠原代睾丸细胞，成功构建了睾丸类器官模型。该模型不仅重现了睾丸组织的关键结构特征，如形成类似精小管的管状结构，还模拟了细胞组织和基因表达谱，与天然组织高度相似。通过优化生物墨水成分和打印参数，研究团队实现了对睾丸细胞发育和功能的支持。此外，该模型在暴露于已知的男性生殖毒性物质雷公藤内酯醇后，显示出紧密连接蛋白CLAUDIN-11的丢失和体细胞标记物转录水平的改变，证明了其在评估男性生殖毒性方面的潜力。

研究结果

1，生物墨水组成和打印参数优化。研究首先优化了光固化3D生物打印睾丸类器官的打印参数和生物墨水组成。从5-7天龄C57BL/6J小鼠分离睾丸细胞，悬浮在生物墨水中，每孔分配20μL混合物打印成约0.5mm高的饼状结构。比较了两种不同的生物墨水配方。材料1包含明胶甲基丙烯酰胺(GelMA)和透明质酸甲基丙烯酸酯(HAMA)的复合物，材料2仅含GelMA。结果显示，材料1制备的类器官在早期培养中细胞活力显著降低，细胞增殖较慢，同时KI67增殖标记物表达降低，凋亡标记物Cleaved CASPASE-3染色增强。相比之下，材料2制备的类器官表现出增强的增殖活性、较低的凋亡水平和更优的结构完整性。

2，机械性能匹配和光固化条件优化。为了模拟天然睾丸组织的机械特性，研究测定了不同GelMA(4-10%)和LAP(0.1-0.2%)浓度的杨氏模量。天然小鼠睾丸组织的弹性模量为3.79±0.94 kPa，6% GelMA和0.2% LAP的组合最接近天然组织硬度。在这些条件下，固化后的生物墨水表面光滑、柔韧，可以完整取出。光固化参数优化显示，在20%曝光强度下，15-16秒曝光产生最佳固化效果。超过16秒或强度超过20%会导致凝胶过于黏稠，黏附在成像设备上或开裂，而较短曝光或较低强度会留下残余液体并导致细胞随时间溢出。

3，类器官形成和基本特征分析。经过14天体外培养后，通过苏木精-伊红(H&E)染色的组织学评估证实了含有原始曲精小管样结构的睾丸类器官的成功形成。这些结构在形态学上以体细胞的同心层包围不同的管腔空间为特征。比较分析两种培养基配方。基础培养基(CM1)与含生长因子和激素添加剂的补充培养基(CM2)显示了显著差异。CM1培养显示有限的细胞迁移和适度的细胞质扩大，而CM2培养表现出广泛的径向迁移，发育出在结构上密切重现天然睾丸形态的复杂结构。细胞活力测定显示，CM1培养基中的细胞在第9天增殖至初始数量的约1.9±0.3倍，而CM2培养基中的细胞在同一时间点达到7.5±0.4倍的增殖率。

4，类器官成熟和细胞类型分析。通过免疫荧光染色评估了14天龄C57BL/6J小鼠睾丸切片中特定细胞类型的标记物。间质细胞的3β-HSD、支持细胞的GATA4、生殖细胞的DDX4和管周肌样细胞的α-SMA。染色显示α-SMA在睾丸内划分出两个不同的区室，GATA4和DDX4主要在沿管壁的内侧区室表达，而3β-HSD定位于外侧区室，散布在小管之间。类器官培养第14天的细胞分布分析显示，类器官表现出α-SMA表达形成类似曲精小管壁的管状结构，GATA4和DDX4显示出与体内模式相似的混合和规律性圆形分布，而3β-HSD主要定位于α-SMA包围腔外，反映了天然睾丸组织中观察到的细胞组织。

5，基因表达谱分析和毒性评估。基因表达分析显示，在三周培养期间(第0、3、7、14和21天)，支持细胞特异性标记物Sox9、Amh和Fshr的表达水平随着类器官成熟而下降，Sox9在初始短暂增加后逐渐下降。间质细胞标记物Hsd3b的表达总体上随时间增加，其他标记物如Star也显示出随培养时间延长而升高的表达。管周肌样细胞标记物Acta2有表达，但其表达随时间稳定下降。生殖细胞标记物Acrv1、Oct4和Scyp3在类器官中有表达，Oct4表达在培养期间显著增加，而Acrv1和Scyp3表达在早期培养阶段初期下降超过一半后逐渐上升。雷公藤内酯醇毒性评估实验确定IC50值为0.1194μM，选择0.01μM(低剂量)、0.1μM(中剂量)和1μM(高剂量)进行后续实验。结果显示中高剂量雷公藤内酯醇显著下调Amh、Fshr、Acta2、Scyp3和Hsd3b的表达水平，Sox9在中剂量时保持不变但在高剂量时显著下调。紧密连接蛋白CLAUDIN-11的免疫染色显示雷公藤内酯醇处理引起CLAUDIN-11的部分缺失，且以剂量依赖性方式减少。

全文总结

本研究成功建立了基于光固化3D生物打印的小鼠睾丸类器官制备技术，为生殖毒理学研究提供了新的体外模型平台。该技术具有高通量、精确设计生物打印材料的优势，能够更好地模拟体内细胞生长环境。研究建立的类器官培养系统支持多种睾丸细胞类型的长期存活和维持，基因表达谱与体内睾丸密切相似，表明生物打印睾丸类器官的成功成熟和功能相关性。通过雷公藤内酯醇的概念验证实验，证明了该平台在毒理学研究中的应用潜力。3D生物打印的可调性允许几何细化，如整合管状腔和多种细胞类型，以更准确地模拟曲精小管结构。与人类诱导多能干细胞(hiPSCs)的整合可能进一步实现睾丸发育和疾病的个性化建模，特别是考虑到健康人类睾丸组织的有限可及性。该类器官系统还支持药物筛选并减少对动物模型的依赖，符合ICH S5指南中概述的3R原则，为男性生殖健康研究和生殖毒性评估提供了重要的技术平台。