农药毒死蜱影响男性生育？新研究揭示：激活特殊自噬引发细胞死亡，破坏生殖屏障是关键！

毒死蜱(CPF)作为一种广泛使用的有机磷农药，其环境残留和健康危害已引发关注，尤其近年研究发现其可导致男性精子发生异常，但具体机制尚未明确。支持细胞作为血睾屏障(BTB)的核心组成，是环境毒物的关键靶标，其功能异常直接影响精子发生。在此背景下，来自重庆医科大学附属儿童医院泌尿外科及儿科研究所的 Shengde Wu、Lianju Shen 和 Guanghui Wei 团队在《Genes & Diseases》(2025, 12:101601)发表研究，首次证实 CPF 通过激活时钟自噬(clockophagy)诱导支持细胞 ferroptosis，降低 HIF-1α 及 BTB 相关蛋白表达，最终破坏 BTB 完整性并导致精子发生障碍，为解析农药致男性生殖毒性的分子机制提供了新视角。

简介

本研究旨在探究毒死蜱(CPF)诱导男性精子发生障碍的机制，通过对青春期雄性 SD 大鼠灌胃不同浓度 CPF(30 天)，结合其代谢物 TCP 处理支持细胞(TM4 细胞)，采用组织病理学、分子生物学及 RNA 测序等方法，发现 CPF 暴露可破坏血睾屏障(BTB)完整性，导致精子数量减少、畸形率升高。进一步研究显示，CPF/TCP 通过激活时钟自噬降解核心昼夜节律蛋白 ARNTL，降低 HIF-1α 表达，诱导支持细胞 ferroptosis(铁离子积累、脂质过氧化增强)，最终下调 BTB 相关蛋白(ZO-1、Occludin 等)，导致精子发生障碍。ferroptosis 抑制剂 ferrostatin-1 可逆转上述变化，证实 ferroptosis 在该过程中的核心作用。

研究背景

毒死蜱(CPF)作为高效有机磷农药，可通过皮肤接触、食物链等途径进入人体，其代谢物 TCP 毒性更强，已被证实对神经、呼吸等系统具有损害作用。近年研究发现 CPF 可导致男性生殖损伤，如睾酮水平下降、精子质量降低，但具体机制不明。

血睾屏障(BTB)由支持细胞间的紧密连接、基底外质特化等结构构成，为精子发生提供免疫豁免微环境，其完整性是正常生精的关键。支持细胞功能异常(如连接蛋白下调)可直接破坏 BTB，导致生精障碍。 Ferroptosis 是铁依赖的脂质过氧化驱动的程序性细胞死亡，参与多种器官损伤;时钟自噬是一种选择性自噬，通过降解 ARNTL(Bmal1)降低 HIF-1α 稳定性，进而诱导 ferroptosis。本研究聚焦 CPF 对支持细胞的影响，探究其是否通过时钟自噬介导的 ferroptosis 破坏 BTB，填补相关机制空白。

实验结果

图 1：CPF 暴露对精子发生的毒性作用

该图显示 CPF 对大鼠生精功能的损害：CPF 处理组(10 mg/kg、20 mg/kg)睾丸生精小管出现空泡和裂隙;精子数量显著减少，畸形率升高;生精细胞标志物 PLZF(精原细胞自我更新)和 Stra8(精母细胞减数分裂)的蛋白表达通过免疫荧光和 Western blot 证实显著下调(P<0.001)。结果表明 CPF 暴露可导致大鼠精子发生异常。

图 2：CPF 暴露破坏血睾屏障(BTB)完整性

该图验证 CPF 对 BTB 的影响：Western blot 显示 CPF 处理组 BTB 相关蛋白(紧密连接蛋白 ZO-1、Occludin;基底外质特化蛋白 N-cadherin、β-catenin;缝隙连接蛋白 Cx43)及肌动蛋白结合蛋白(Arp3、Eps8)表达显著降低(P<0.05);免疫荧光显示这些蛋白定位未变(仍位于基底区);生物素追踪实验显示 CPF 处理后生物素穿透 BTB 进入生精小管腔，证实 BTB 完整性被破坏。提示 CPF 通过下调 BTB 相关蛋白破坏屏障功能。

图 3：TCP 暴露损害支持细胞连接功能

该图探究 CPF 代谢物 TCP 对支持细胞的直接影响：CCK-8 实验显示 50 μM TCP 处理 24 小时显著降低 TM4 细胞活力(P<0.05)，选为后续浓度;Western blot 和免疫荧光证实 TCP 处理下调支持细胞中 BTB 相关蛋白及 Arp3、Eps8 的表达(定位未变);鬼笔环肽染色显示肌动蛋白细胞骨架紊乱。结果表明 TCP 可直接破坏支持细胞连接功能。

图 4：TCP 通过诱导 ferroptosis 破坏支持细胞连接功能

该图解析 TCP 影响支持细胞的机制：RNA 测序显示 TCP 处理后 368 个基因上调、60 个基因下调，KEGG 富集于 ferroptosis 通路;TCP 处理使细胞内 Fe²⁺、MDA(脂质过氧化产物)升高，GSH(抗氧化剂)和 GPX4(ferroptosis 关键酶)降低，ROS 及死细胞数量增加，脂质过氧化增强(P<0.05);ferrostatin-1 可逆转上述变化，并恢复 BTB 相关蛋白表达。证实 TCP 通过诱导 ferroptosis 破坏支持细胞连接功能。

图 5：TCP 通过激活时钟自噬诱导支持细胞 ferroptosis

该图探究 ferroptosis 的上游调控：TCP 处理使支持细胞中 ARNTL(时钟自噬靶蛋白)、HIF-1α 表达降低，p62(自噬底物)、PHD1(HIF-1α 降解酶)及溶酶体功能标志物(ATP6V0D1、LAMP2)升高，LC3B II/I 比值降低(提示自噬降解增强);LysoTracker 和 LysoSensor 显示溶酶体数量增加、功能增强;Ad-mCherry-GFP-LC3B 实验证实自噬流增强;氯喹(CQ，自噬抑制剂)可抑制 ARNTL 降解，ferrostatin-1 可恢复 ARNTL 和 GPX4 表达。表明 TCP 通过激活时钟自噬(降解 ARNTL)诱导 ferroptosis。

图 6：ARNTL 敲低损害支持细胞连接功能

该图验证 ARNTL 的作用：siRNA 敲低 ARNTL(效率约 80%)后，支持细胞中 PHD1 升高，HIF-1α 和 GPX4 降低，BTB 相关蛋白(ZO-1、Occludin 等)表达显著下调(P<0.05)。证实 ARNTL 缺失可直接破坏支持细胞连接功能，是时钟自噬介导损伤的关键分子。

图 7：CPF 在体内诱导睾丸 ferroptosis 及时钟自噬激活

该图在动物层面验证机制：CPF 处理使大鼠睾丸组织中 Fe²⁺、MDA 升高，GSH 和 GPX4 降低(ferroptosis 特征);Western blot 显示 ARNTL、HIF-1α、LC3B II/I 降低，p62、PHD1、ATP6V0D1、LAMP2 升高(时钟自噬激活)。结果与体外实验一致，证实 CPF 在体内通过激活时钟自噬诱导睾丸 ferroptosis。

研究结论

本研究证实，毒死蜱(CPF)通过其代谢物 TCP 激活时钟自噬，选择性降解核心昼夜节律蛋白 ARNTL，导致 HIF-1α 稳定性下降，进而诱导支持细胞 ferroptosis(铁积累、脂质过氧化增强)，使血睾屏障(BTB)相关蛋白表达下调，最终破坏 BTB 完整性并引发精子发生障碍。ferroptosis 抑制剂可逆转该过程，提示靶向 ferroptosis 或时钟自噬可能为防治农药致男性生殖损伤提供新策略。研究同时指出，需进一步探索低剂量长期暴露的影响及不同年龄段的敏感性差异。