工程化骨化中心类器官的"分而治之"策略通过发育性细胞募集实现快速骨愈合

传统的骨缺损修复方法主要依赖于局部递送生长因子来耦合血管生成和骨生成，但关键尺寸骨缺损的血管重建和再生延迟仍然是临床难题。当前的生物医学策略通过递送干细胞或高剂量生长因子来模拟成熟骨组织，但由于细胞活力有限、血管供应不足和不可避免的异位骨形成，产生了不一致的结果。发育性组织工程最近受到广泛关注，通过设计基于细胞的构建体并结合发育生物学概念来应对严酷的再生条件。间充质干细胞聚集体能够形成细胞球体并产生矿化基质和支持骨髓造血的微环境，但无支架构建体需要延长的体外软骨诱导或天然组织粘附才能进行体内应用。

神经营养因子在促进内源性骨骼干细胞亚群的原位募集和扩增方面显示出巨大潜力。最近的研究表明，神经营养蛋白导向的神经支配在促进血管化和骨软骨谱系分化方面发挥重要作用。再神经支配先于血管生成和骨生成，神经生长因子-TrkA信号的破坏强烈阻碍了骨折愈合过程中的血管重建和骨化。然而，由于缺乏针对序贯组织形态发生而设计的发育性生物仿生生物材料，关键尺寸缺损的骨愈合速度和全层再生仍然具有挑战性。因此，迫切需要开发能够长期保留可吸收生物材料、强效干细胞和生理相关可溶性因子的替代方法。

近期，浙江大学医学院欧阳宏伟团队发布在Nature communications期刊，题为Divide-and-conquer strategy with engineered ossification center organoids for rapid bone healing through developmental cell recruitment的研究设计了一个骨化中心样类器官(OCO)，它由一个内核骨形态发生和神经营养球体组成，该球体通过载有MSC的3D打印生成，以及一个间质分布的外层促血管生成神经营养相。结果表明，通过“分而治之”的方式，OCO的集体植入能够快速实现骨桥形成，并在骨缺损处连续形成类似OC的骨小体。

研究结果

1，CGRP与BMP-2的协同作用促进成骨分化

研究首先评估了不同神经肽对间充质干细胞成骨分化的影响。结果显示，降钙素基因相关肽(CGRP)显著增强了成骨分化，而血管活性肠肽(VIP)和神经肽Y(NPY)没有明显优势。进一步研究发现，CGRP与生理剂量的BMP-2(0.5 μg/ml)联合使用时产生协同效应，显著提高了ALPL和RUNX2基因表达，ALP染色和茜素红染色也证实了这种增强的成骨分化能力。免疫染色显示CGRP处理后Ki67表达显著增加，而细胞衰老标志物γh2AX表达显著降低，表明CGRP能维持MSC的增殖能力并减少细胞衰老。

图1 CGRP协同促进BMP-2在生理剂量下MSCs的成骨分化

2，3D打印技术制备骨化中心样类器官

利用数字光处理(DLP) 3D打印技术制备了载有MSCs的GelMA/HA-NB水凝胶微球。比较了直径100μm、200μm和400μm的微球，发现400μm直径的微球具有最高的细胞存活率和后续细胞扩增能力。细胞在微球内均匀分布，14天内细胞数量增加约5倍，且保持高细胞活力。成骨诱导实验显示，载有BMP-2和CGRP的细胞载微组织在ALP合成、ARS染色以及成骨标志物RUNX2和OCN表达方面均显著增强，证明了这种"一体化"生物打印技术能有效工程化具有高成骨潜能的"骨化中心"样球体。

图2 基于3D打印的“骨化中心”样球体的制造，增强了细胞存活和成骨潜力

3，"分而治之"策略实现快速骨桥接

开发了双模块水凝胶系统，内核含有BMP-2，外壳含有P物质(SP)，实现了生长因子的空间时间控制释放。体内实验中，将工程化的骨化中心样类器官(OCO)植入大鼠颅骨缺损模型。μ-CT分析显示，OCO组在4周时实现了近乎完全的骨桥接，呈现蜂窝状结构，而对照组和混合组仍存在大量缺损区域。8周后，OCO组实现了整个缺损区域的实质性骨再生，骨体积分数、骨矿密度以及新旧骨整合程度均显著高于其他组。组织学分析显示，OCO通过原位融合形成连续的OC样骨小梁，实现了颅骨缺损的全层重建。

图3 OCO植入术可实现快速骨桥接和全层重建，通过连续的OC样类器官融合跨越骨缺损

4，OCO原位融合促进神经支配、血管化和骨化

免疫荧光染色分析揭示了OCO植入后的生物学过程。4周后，OCO刺激了β-III微管蛋白阳性和CGRP阳性感觉神经元细胞的强烈聚集和分布，而对照组和混合组仅有零星的神经支配。随着软骨样组织的肥大成熟(COLX表达)，血管侵入通过内皮标志物CD31染色得到证实。伴随着增强的神经支配和血管化，多个OCO内核最终被更多的OCN和RUNX2阳性细胞包围，并表达胶原I，最终转变为骨髓腔。这些结果表明OCO植入通过内软骨骨化途径促进快速骨再生，展现了与天然骨化中心发育相似的序贯神经支配、血管化和骨化过程。

图4 OCO的原位融合和成熟再现了骨化中心的发展，同时伴有神经支配、血管形成和骨化

5，单细胞RNA测序揭示细胞群落组织

通过单细胞RNA测序分析了OCO融合和成熟2周后的细胞图谱，获得了39,471个细胞的数据。分析识别出15个细胞簇，包括B/T细胞、单核细胞/巨噬细胞、内皮细胞、骨谱系细胞(OLCs)、周细胞和神经嵴细胞。进一步的亚聚类分析将OLCs分为9个亚群，包括Has1+迁移性成纤维细胞、Mfap5hi间充质祖细胞、Thy1hi骨骼干细胞、Krt8+骨骼干细胞、Ucma+骨软骨祖细胞、软骨母细胞、骨祖细胞、Lyz2+成纤维细胞和增殖性间充质细胞。这些亚群组织成4个独立的细胞群落，每个群落都具有特定的分子特征和空间分布模式。

图5 单细胞RNA序列显示了骨系细胞的异质性和骨修复中的紧密联系

6，Krt8+骨骼干细胞的发育性意义

机器学习分析比较了骨再生与骨发育的跨物种相似性。通过整合公开的小鼠和人类胚胎骨发育数据集，发现Krt8+骨骼干细胞在骨再生和骨发育过程中都发挥重要作用。人类儿童指骨组织的免疫染色验证了Krt8在骨形成前沿的丰富分布，Krt8+Msx1+双阳性细胞聚集在骨形态发生中心的中央区域。HGBoost模型预测显示，Krt8+骨骼干细胞参与发育和损伤修复过程，而Krt8+骨骼干细胞/Has1+迁移性成纤维细胞的相对比例在骨再生中与发育性骨组织中的比例高度相似，证明了OCO策略的发育生物学基础。

图6 通过机器学习进行的跨物种比较显示，Krt8+ SSCs在骨再生中的相似性与骨发育中的相似性很高

全文总结

本研究提出了一种基于工程化骨化中心类器官的"分而治之"新策略，为关键尺寸骨缺损的快速再生提供了创新解决方案。通过模拟天然骨化中心的发育过程，成功实现了神经支配、血管化和骨化的协调进行，显著缩短了骨愈合时间。单细胞RNA测序技术的应用深入揭示了骨再生过程中的细胞异质性和发育性机制，特别是Krt8+骨骼干细胞在促进骨再生中的关键作用。这一发现不仅拓展了对骨再生细胞生物学机制的理解，也为骨组织工程提供了新的理论基础。该研究结合了3D生物打印、发育生物学和单细胞基因组学等前沿技术，为未来的再生医学研究和临床应用提供了重要参考，具有重要的科学价值和临床转化潜力。