通过持续激活 toll 样受体 - 2（TLR2）促进肿瘤抗原交叉呈递的支架疫苗

同源异体小鼠肿瘤模型是免疫肿瘤学(I/O)研究中不可或缺的临床前模型，但它们对免疫检查点抑制剂(ICIs)的反应有限，这可能是由于它们的固有低免疫原性。为了解决这一问题，研究人员通过将鸡卵清蛋白(OVA)这一高度免疫原性的蛋白质表达到同源异体肿瘤细胞中，开发了新的免疫原性同源异体模型。这些模型，如DC2.4-OVA和B16-OVA，显示出比它们的亲本细胞系更慢的肿瘤生长速度，这可能是由于免疫介导的排斥反应。更重要的是，这些OVA表达的模型对ICIs，特别是抗PD-1治疗，表现出更高的敏感性，这表明它们在增强T细胞介导的免疫反应方面具有潜力。此外，通过过继T细胞转移实验，研究人员验证了这些模型中存在肿瘤特异性记忆T细胞。这些结果表明，OVA工具细胞不仅增强了对ICIs的反应，而且为临床前免疫治疗评估提供了新的、具有更高免疫原性的同源异体模型，这对于I/O研究具有重要的意义。

基本信息

英文标题：A scaffold vaccine to promote tumor antigen cross-presentation via sustained toll-like receptor-2 (TLR2) activation

中文标题：通过持续激活 toll 样受体 - 2(TLR2)促进肿瘤抗原交叉呈递的支架疫苗

发表期刊：《Bioactive Materials》

影响因子：20.3

作者单位：

1. State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine, Institute of Chinese Medical Sciences, University of Macau, Taipa, Macau SAR, China

2. State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, School of Life Sciences, Nanjing University, Nanjing, 210093, China

3. Department of Chemistry, CICECO – Aveiro Institute of Materials, University of Aveiro, Campus Universitário de Santiago, 3810-193, Aveiro, Portugal

作者信息：

Daping Xie, Congwei Han, Chonghao Chen

研究背景

癌症疫苗的关键挑战在于难以有效激活细胞毒性 CD8⁺ T 细胞，而抗原交叉呈递(抗原呈递细胞通过 MHC-I 将肿瘤抗原呈递给 CD8⁺ T 细胞)是解决这一问题的核心。现有方法存在 ROS 产生无选择性、需额外佐剂、动力学失控等缺陷。本研究开发了一种 3D 可注射支架疫苗，通过持续激活 TLR2，诱导树突状细胞(DCs)产生适度 ROS，促进抗原从内体逃逸，增强交叉呈递。该支架通过疏水相互作用 “捕获” TLR2 激动剂 acGM，皮下注射后通过点击化学形成多孔结构，实现 acGM 的缓释，无需额外佐剂或外部刺激，在多种肿瘤模型中验证了其有效性。

研究方法

通过双乳化法制备载抗原(OVA 或肿瘤特异性抗原 TSA)的 acGM 纳米颗粒，将透明质酸(HA)修饰不同疏水基团(C6、C14、DOCA)，利用点击化学与 PEG-8DBCO 交联形成 3D 支架，通过疏水作用实现 acGM 的缓释。体外实验评估 BMDCs 中 ROS 动力学、抗原逃逸及交叉呈递效率;体内实验通过皮下注射支架疫苗，监测 DC 募集、活化及 CD8⁺ T 细胞响应，在 B16-OVA 荷瘤小鼠(局部肿瘤、肺转移模型)和 Apc^Min/+ 转基因小鼠(自发性结直肠癌模型)中验证疫苗的抗肿瘤效果，结合流式细胞术、免疫荧光等分析免疫应答机制。

实验结果

图1：细胞内 ROS 动力学对抗原呈递模式的影响

A 图显示不同浓度和频率的 acGM 处理 BMDCs 的 ROS 动力学，4 次 100 μg/mL acGM 处理可诱导持续高 ROS;

B 图证实该浓度无细胞毒性;

C、D 图通过共定位显示持续 ROS 促进溶酶体破坏和抗原(OVA)逃逸;

E 图验证 ROS 产生依赖 TLR2 激活;

F、G 图表明持续 ROS 显著增强 MHC-I 交叉呈递，且依赖蛋白酶体;

H 图显示 25D1.16(MHC-I-OVA 复合物)表达受 Bzb 抑制。结果证实，持续 TLR2 激活诱导的 ROS 动力学是高效交叉呈递的关键。

图2：可注射 3D 支架疫苗的设计及 acGM 保留能力

A、B 图展示 HA 疏水修饰(C6、C14、DOCA)与 acGM 的相互作用;

C 图通过 FRET 验证 DOCA-HA 与 acGM 的最强结合(效率 38.73%);

D、E 图显示支架通过点击化学形成多孔结构，可注射且生物相容性良好;

F 图释放曲线表明 DOCA-HA 支架对 acGM 保留最佳(6 天保留 > 50%)。结果表明，疏水修饰可调控 acGM 的缓释，为持续 TLR2 激活奠定基础。

图3：支架疫苗在体内促进 DC 成熟和 ROS 产生

A、B 图显示 DOCA-HA/OVA@acGM 支架募集更多 CD11c⁺ DCs 且成熟(CD86⁺)比例更高;C-F 图表明该组 DCs 的 ROS⁺比例在局部和淋巴结中均显著升高;G、H 图显示淋巴结中 CD8⁺/CD4⁺ T 细胞比例显著增加。结果证实，支架疫苗可通过持续释放 acGM，促进 DCs 活化和 ROS 产生，增强适应性免疫应答。

图4：OVA 负载支架疫苗抑制 B16-OVA 皮下肿瘤生长

A 图为实验方案(-14 天接种疫苗，0 天接种 B16-OVA 肿瘤细胞);

B-D 图显示 DOCA-HA/OVA@acGM 组诱导的抗 OVA IgG、IgG1、IgG2c 水平最高，其中 IgG2c/IgG1 比值(Th1 型免疫标志)显著高于其他组(约为对照组的 2 倍);

F 图肿瘤生长曲线显示，该组 18 天时肿瘤体积仅为对照组的 1/4，显著小于 OVA@acGM 组和 HA/OVA@acGM 组;G 图肿瘤实物照片直观呈现各组大小差异;

H 图生存曲线表明，该组小鼠中位生存期达 70 天，显著长于对照组(约 40 天);

I 图 TUNEL 染色显示，该组肿瘤细胞凋亡率最高(绿色荧光标记)。结果证实，DOCA-HA/OVA@acGM 支架疫苗可通过增强体液免疫和细胞免疫，强效抑制皮下肿瘤生长并延长荷瘤小鼠生存期。

图5：OVA 负载支架疫苗在野生型小鼠中诱导针对 B16-OVA 皮下肿瘤的强效 CD8⁺T 细胞免疫应答

A 图流式分析显示 DOCA-HA/OVA@acGM 组肿瘤浸润 T 细胞中 CD8⁺T 细胞比例最高;B-D 图量化表明该组 CD4⁺T 细胞增加、Treg(CD4⁺Foxp3⁺)减少、CD8⁺T 细胞显著富集;E 图免疫荧光显示更多 CD8⁺T 细胞浸润;F-H 图显示该组 CD8⁺T 细胞中 Ki67⁺(增殖)、IFN-γ⁺(效应)及 OVA 特异性(OVA-Tet⁺)比例最高。结果证实，支架疫苗可诱导强效抗原特异性 CD8⁺T 细胞应答，增强肿瘤杀伤。

图6：支架疫苗对野生型小鼠肺癌转移的抑制及免疫记忆诱导

A 图为肺转移实验方案;

B-D 图显示 DOCA-HA/OVA@acGM 组肺转移灶数量最少(约为对照组 1/3)，H&E 染色验证转移抑制;

E 图显示该组小鼠生存时间最长;

F-H 图表明其脾脏中效应记忆 T 细胞(CD8⁺CD44⁺CD62L⁻)比例高，OVA 肽刺激后 IFN-γ 分泌及肿瘤细胞裂解率显著升高。结果证实，支架疫苗可诱导长效免疫记忆，有效抑制肿瘤转移。

图7：TSA 负载支架疫苗对 Apc^Min/+ 转基因小鼠自发性结直肠癌的抑制

A 图为实验方案;B 图显示 DOCA-HA/TSA@acGM 组 CD8⁺T 细胞分泌 IFN-γ 显著增加;C-D 图表明该组结肠肿瘤总数减少，大肿瘤(≥4mm)比例降低;E 图 TUNEL 染色显示肿瘤细胞凋亡增加;F-I 图显示肿瘤中 CD8⁺T 细胞浸润增加，Ki67⁺增殖细胞比例高，且 IFN-γ、颗粒酶 B 分泌增强。结果证实，支架疫苗对自发性肿瘤同样具有强效抑制作用。

研究结论

本研究开发了一种基于多糖的 3D 可注射支架疫苗，通过疏水修饰的透明质酸(DOCA-HA)与 TLR2 激动剂 acGM 的相互作用，实现 acGM 的持续释放，从而在树突状细胞(DCs)中诱导持续的 ROS 产生。这种优化的 ROS 动力学可促进肿瘤抗原从溶酶体逃逸，增强 MHC-I 介导的交叉呈递，显著激活 CD8⁺T 细胞应答。在 B16-OVA 皮下肿瘤模型中，该疫苗能抑制肿瘤生长并延长生存期;在肺转移模型中，可诱导长效免疫记忆以减少转移灶;在 Apc^Min/+ 小鼠自发性结直肠癌模型中，也能有效减少肿瘤数量并增强抗肿瘤免疫。该疫苗无需额外佐剂或外部刺激，生物相容性良好，且可适配不同抗原(OVA、TSA)，为个性化癌症疫苗的开发提供了新策略。