具有内体逃逸能力的阳离子聚合物胶束结构开发，实现 mRNA-LNPs 肌内转染效率提升

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具

基本信息

英文标题：Development of a Cationic Polymeric Micellar Structure with Endosomal Escape Capability Enables Enhanced Intramuscular Transfection of mRNA-LNPs

中文标题：具有内体逃逸能力的阳离子聚合物胶束结构开发，实现 mRNA-LNPs 肌内转染效率提升

发表期刊：《Vaccines》

影响因子：3.4

作者单位：

1. Shenzhen Neocurna Biotechnology Corporation, 12/F, Block B, Building 1, Yinxingzhijie Phase II, Longhua District, Shenzhen 518100, China

2. NeoCura Bio-Medical Technology Co., Ltd., 12/F, Block B, Building 1, Yinxingzhijie Phase II, Longhua District, Shenzhen 518100, China

作者信息：

Siyuan Deng1,Han Shao1, Hongtao Shang,

研究背景

信使 RNA(mRNA)疗法在传染病、癌症和蛋白质替代疗法等领域展现出巨大潜力，而递送系统对 mRNA 疗法至关重要，其需保护 mRNA 不被降解、促进细胞内释放并实现有效表达。脂质纳米颗粒(LNPs)是 mRNA 递送的先进平台，但存在内体逃逸效率低、胞质 mRNA 释放有限等挑战。尽管有多种策略尝试增强 LNPs 的内体逃逸效率，但调整 LNP 配方可能影响其其他特性，而阳离子聚合物虽有潜力，却受限于细胞毒性。本研究提出一种新策略，通过共递送独立于 LNP 的阳离子聚合物胶束(cPM)来克服内体逃逸限制。

研究方法

研究通过可逆加成 - 断裂链转移(RAFT)聚合合成阳离子两亲性二嵌段共聚物，再经分散 - 扩散法制备 cPM，利用动态光散射(DLS)和冷冻透射电镜(CryoTEM)进行表征。通过溶血实验评估 cPM 的膜破坏活性，采用两种常用 LNPs(SM102 LNP 和 Dlin-MC3-DMA LNP)负载萤火虫荧光素酶(Fluc)mRNA 进行体内功能测定。将 cPM 与 LNP-mRNA 通过肌内注射共给药，使用 IVIS Spectrum 系统检测荧光素酶表达，以评估 cPM 对 mRNA-LNPs 转染效率的影响。

实验结果

图1：p (PEG4-5MA-co-HMA) 作为大分子链转移剂的合成路线

通过可逆加成 - 断裂链转移(RAFT)聚合反应，将聚乙二醇 4-5 甲基丙烯酸酯(PEG4-5MA)与己基甲基丙烯酸酯(HMA)在引发剂 AIBN 和链转移剂 CPA 作用下聚合，生成亲水段共聚物 p (PEG4-5MA-co-HMA)。该大分子链转移剂经透析和旋转蒸发纯化后，用于后续二嵌段共聚物的合成，其单体整合率达 85.7%，接近投料比的 78%，证实了聚合反应的可控性。

图2：二嵌段共聚物 p (PEG4-5MA-co-HMA) X-b-p (BMA-co-DMAEMA-co-PAA) Y 的合成路线

以 p (PEG4-5MA-co-HMA) 为大分子链转移剂，与甲基丙烯酸丁酯(BMA)、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)和丙烯酸丙酯(PAA)进行 RAFT 聚合，制得阳离子二嵌段共聚物。该聚合物产率为 70.77%，数均分子量(Mn)为 39.8 kDa，分子量分布指数(Ð)为 1.4，其结构经 1H-NMR 验证，疏水段由 50.0% BMA、36.2% DMAEMA 和 13.8% PAA 组成。

图3：cPM、SM102 LNP-mRNA 和 MC3 LNP-mRNA 的冷冻透射电镜(CryoTEM)图像

cPM 呈近似球形，表面粗糙，粒径约 30-40 nm，与动态光散射(DLS)测得的 61.31 nm 差异源于溶液中阳离子胶束的聚集效应;SM102 LNP 和 MC3 LNP 均为均一球形纳米颗粒，粒径约 80-90 nm，显示出良好的脂质纳米粒结构特征。

图4：cPM 和 PC-cPM 的膜破坏活性及对 LNP 稳定性的影响

在模拟早期内体 pH 6.5 条件下，cPM 与 SM102 LNP 共孵育使溶血率从 5% 提升至 80%，而蛋白冠层修饰的 PC-cPM 溶血率达 50%，证实 cPM 在酸性环境中可增强膜破坏能力;当 cPM 浓度超过 31.25 μg/mL 时，SM102 LNP 的 mRNA 封装效率(% EE)降至 50%，而 PC-cPM 可将 % EE 维持在 85%，表明蛋白冠层能缓解 cPM 对 LNP 稳定性的影响。

图5：cPM 对 HeLa 细胞的毒性评估

通过 CCK8 实验发现，cPM 浓度≤100 μg/mL 时，HeLa 细胞存活率超过 90%;当浓度在 250-1000 μg/mL 时，细胞活力降至 75%，显示 cPM 在较低浓度下具有良好的细胞相容性，仅高浓度时表现出轻度细胞毒性。

图6：cPM 与 LNP-mRNA 分腿肌内注射的体内荧光成像

小鼠注射 MC3 LNP-Fluc mRNA 与 20 mg/kg cPM(分腿给药)后，注射部位的荧光信号较单独 MC3 LNP 组增强 2-3 倍;SM102 LNP 组也观察到类似趋势，且 cPM 剂量为 20 mg/kg 时效果最佳，30 mg/kg 剂量未进一步提升信号，可能与肝脏非特异性摄取增加有关。

图7：cPM 辅助 LNP-mRNA 递送的机制示意图

cPM 与 LNP-mRNA 分腿注射后，cPM 通过毛细血管进入血液循环，形成蛋白冠层(PC-cPM);随后 PC-cPM 到达 LNP 注射部位，与 LNP 共内吞进入细胞，在酸性内体中释放并破坏内体膜，促进 mRNA 胞质释放，最终提升荧光素酶表达效率。

研究结论

本研究开发的 cPM 粒径为 61.31±0.68 nm，zeta 电位为 37.76±2.18 mV，在小鼠肌内注射后，与对照组相比，注射部位的萤火虫荧光素酶信号高出 2-3 倍，表明 cPM 能有效增强 mRNA-LNPs 的内体逃逸效率。该 cPM 无需修改 mRNA-LNPs 的固有特性，避免了配方特性的不可预见变化，为提高递送的 mRNA 表达效率提供了有前景的策略，这种基于聚合物的纳米材料在 mRNA 疫苗的临床应用中具有巨大潜力。