靶向抗癌的化合物竟是检测干扰剂？这项研究揭开药物筛选的 "障眼法"

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具。

基本信息

英文标题：A Putative Frizzled 7‑Targeting Compound Acts as a Firefly Luciferase Inhibitor

中文标题：一种假定的 Frizzled 7 靶向化合物作为萤火虫荧光素酶抑制剂

发表期刊：《Journal of Medicinal Chemistry》

影响因子：6.0

作者单位：

1.Section of Receptor Biology & Signaling, Dept. Physiology & Pharmacology, Karolinska Institutet, Stockholm S-171 77, Sweden

2.Department of Chemistry and Pharmacy, Friedrich-Alexander-Universität, Erlangen 91058, Germany

作者信息：

Julia Kinsolving, Lukas Grätz, Jan Hendrik Voss

研究背景

Frizzled(FZD)家族作为 G 蛋白偶联受体，可调节 WNT 信号传导，该信号对胚胎发育和成人组织稳态至关重要，而 FZD 失调及 WNT/β-catenin 信号过度激活在肠道癌症等多种肿瘤中常见，故 FZD 成为癌症治疗的潜在靶点。基于结构的虚拟筛选已发现化合物 28，其据报道可通过基于荧光素酶的 TOPFlash 报告基因实验抑制 WNT/β-catenin 信号，但经药理验证，化合物 28 实则是强效的萤火虫荧光素酶(Fluc)抑制剂，且通过 Fluc 非依赖实验(如 FZD 聚焦的生物发光共振能量转移生物传感器和定量 PCR)证实其无法抑制 WNT-3A 诱导的 FZD 构象动态变化及 WNT 靶基因 Axin2 的转录，这凸显了反筛实验在验证干扰筛选技术的化合物时的重要性。

研究方法

研究人员首先按已发表方案合成化合物 28(即化合物 3)，并通过 HPLC 和 1H NMR 验证其纯度 > 95%。接着，在 ΔFZD1-10 HEK293T 细胞(经 CRISPR/Cas9 敲除内源性 FZD)和野生型小鼠胚胎成纤维细胞(WT-MEFs)中开展实验：利用 TOPFlash 荧光素酶报告基因实验，检测化合物 3 对 WNT-3A 诱导的 β-catenin 信号的影响;通过在细胞中表达由 CMV 启动子驱动的 Fluc，探究化合物 3 对 Fluc 活性的抑制作用，并检测其对 Rluc 和 Nluc 的影响;运用 FZD7-DEP-Clamp 生物传感器(基于 BRET)，评估化合物 3 对 WNT-3A 诱导的 FZD7 构象变化的影响;通过 qPCR 检测 WT-MEFs 中 WNT-3A 诱导的 Axin2 mRNA 表达，分析化合物 3 的作用。

实验结果

图1：化合物 3 消除基础和 WNT-3A 诱导的 TOPFlash 信号

该图展示了化合物 3(即化合物 28)对 WNT/β-catenin 信号的影响。实验在 ΔFZD1-10 HEK293T 细胞中进行，细胞转染 HiBiT-FZD7、TOPFlash 质粒(含 TCF/LEF 结合位点调控的 Fluc)和 Rluc 质粒。结果显示，WNT-3A(300 ng/mL)可显著增加 TOPFlash 比率，而化合物 3(10 μM)完全消除了基础及 WNT-3A 诱导的 TOPFlash 信号，使其低于基础水平，这与之前的报道一致，但需进一步探究其作用机制。

图2：化合物 3 是强效的萤火虫荧光素酶抑制剂

此图证实化合物 3 对 Fluc 的抑制作用。在 ΔFZD1-10 HEK293T 细胞中，Fluc 由 CMV 启动子驱动(不依赖 WNT 信号)，化合物 3 以浓度依赖方式抑制 Fluc 活性，IC50 为 25 nM，与 TOPFlash 实验中抑制 WNT 信号的 IC50 一致。同时，化合物 3 对 Rluc 无影响，且在无 FZD 和 WNT 的情况下，对 CHIR99021 诱导的 TOPFlash 信号仍有抑制作用，IC50 为 33 nM，表明其特异性抑制 Fluc，而非作用于 FZD 或 WNT 通路。

图3：正交实验表明化合物 3 对 WNT 诱导的构象重排或真实 WNT 靶基因 Axin2 无影响

该图通过正交实验验证化合物 3 的作用。FZD7-DEP-Clamp 生物传感器检测显示，WNT-3A 可诱导 FZD7 构象变化，但化合物 3(10 μM)对该信号无影响;对胞质 Nluc 的检测表明化合物 3 不影响其活性，排除对 BRET 实验的干扰;qPCR 结果显示，WNT-3A 可诱导 WT-MEFs 中 Axin2 mRNA 表达，而化合物 3 不影响该转录过程。综上，化合物 3 不作用于 FZD7 或 WNT/β-catenin 通路，其对 TOPFlash 信号的抑制源于 Fluc 抑制。

研究结论

化合物 28 并非 FZD7 靶向抑制剂，而是强效的 Fluc 抑制剂，其 IC50 为 30 nM，与 TOPFlash 实验中抑制 WNT/β-catenin 信号的 IC50 一致。正交实验表明，其不影响 WNT-3A 诱导的 FZD7 构象变化及 Axin2 基因转录，对 TOPFlash 信号的抑制完全源于对 Fluc 的抑制。该研究强调，在药物筛选中，尤其基于荧光素酶报告基因的实验，必须引入反筛实验以排除化合物对检测技术的干扰，避免假阳性结果，这对 FZD 靶向化合物及其他基于筛选的药物研发具有重要指导意义。