BODIPY - 腔肠素偶联物作为 NanoLuc 的自发光底物

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题：BODIPY-coelenterazine conjugates as self-illuminating substrates for NanoLuc

中文标题：BODIPY - 腔肠素偶联物作为 NanoLuc 的自发光底物

发表期刊：《Chemical Communications》

影响因子：4.2

作者单位：

1.Department of Chemistry, Marburg University, Marburg, Germany

2.Department of Physics and Materials Science Center, Marburg University, Marburg, Germany

3.Princeton Precision Health (PPH), Princeton University, Princeton, USA

4.Lewis-Sigler Institute for Integrative Genomics, Princeton University, Princeton, USA

作者信息：

Valeska Viereckt, Marina Gerhard, Olalla Vázquez

研究背景

生物发光技术因高灵敏度和生物相容性，广泛用于生物过程研究及检测。NanoLuc(NLuc)作为半合成荧光素酶，在亮度、稳定性和尺寸上优于传统酶，其分裂版本 NanoBiT(LgBiT 与 HiBiT 肽)进一步拓展了应用场景。腔肠素(CTZ)是 NLuc 的关键底物，而 BODIPY 类荧光染料具有优异的光谱特性和光动力活性，但 BODIPY-CTZ 偶联物的研究尚未开展。本文设计了新型 BODIPY-CTZ 偶联物，旨在结合 CTZ 的生物发光特性与 BODIPY 的荧光 / 单线态氧生成能力，探索其在生物发光共振能量转移(BRET)、光动力治疗(PDT)等领域的应用潜力。

研究方法

研究人员设计并合成了 BODIPY - 腔肠素(CTZ)偶联物，通过 Horner-Wadsworth-Emmons 烯烃化反应和钯催化的 Hartwig-Buchwald N - 芳基化反应构建 CTZ 核心，再经 NHS 酯形成反应与 BODIPY 偶联，得到短链(3、4)和长链(5、6)衍生物，并用 HPLC 和核磁共振验证结构。随后，利用 DPBF 陷阱法检测单线态氧(1O2)生成，通过荧光光谱和寿命测定评估偶联物的荧光效率，基于 FRET 理论建模分析能量转移机制。此外，使用 NanoBiT 系统(LgBiT-HiBiT)检测偶联物的生物发光活性，通过发光光谱分析 BRET 效率，利用 Si-DMA 探针检测酶催化下的 1O2 生成。

实验结果

图1：BRET 光谱重叠证据及目标偶联物的化学结构

图 1 展示了 BODIPY 荧光发射光谱与 CTZ 吸收光谱的重叠情况，二者在波长分布上的重叠为 BRET(生物发光共振能量转移)过程提供了能量转移的基础，同时图中还呈现了设计的 BODIPY-CTZ 偶联物(3–6)的化学结构，包括短链非卤代物 3、短链卤代物 4、长链非卤代物 5 和长链卤代物 6，这些偶联物通过不同长度的连接链将 BODIPY 与 CTZ 结合，卤代物在 BODIPY 结构中引入碘原子以增强光动力特性。

图2：偶联物的供体 - 受体距离与取向因子比较

该图对比了短链 2I-BODIPY-CTZ(4)和长链 2I-BODIPY-CTZ(6)的供体 - 受体距离及过渡偶极矩的取向因子，结果显示短链偶联物 4 的供体 - 受体距离虽小于长链偶联物 6，但取向因子更差，这种差异导致短链偶联物的 FRET 效率低于长链偶联物，且该趋势在非卤代偶联物 3 和 5 中也同样存在，表明供体 - 受体的空间取向对能量转移效率的影响大于距离本身。

图3：偶联物的生物发光与单线态氧检测

图 3 通过三个部分展示了偶联物的生物活性：A 部分测定了短链非卤代物 3 和长链非卤代物 5 作为 NanoLuc 底物的米氏常数，发现长链偶联物 5 的 Km 值更低，且动力学符合底物抑制模型，表现出更高的生物发光效率;B 部分的发光光谱显示，长链偶联物 5 在 518 nm 处有 BODIPY 特征发射峰，证实发生了 BRET，而短链偶联物 3 在 458 nm 处的发射峰表明未触发能量转移;C 部分利用 Si-DMA 探针检测到长链卤代偶联物 6 在较低浓度下即可产生单线态氧，且酶与 Si-DMA 的相互作用增强了荧光信号，验证了其光动力活性。

研究结论

BODIPY-CTZ 偶联物保留了 CTZ 作为 NanoLuc 底物的活性，长链偶联物(5、6)因供体 - 受体取向更优，BRET 效率和生物发光强度更高。卤代 BODIPY 偶联物(4、6)光照下可产生 1O2，虽量子产率低于游离 BODIPY，但酶催化生物发光可触发 1O2 释放。该偶联物兼具生物发光与光动力活性，可作为自发光探针用于 BRET 成像或通过酶激活实现 1O2 触发的药物释放，为精准医疗提供新工具。