宿主 - 病毒基因组联合分析揭开乙肝病毒逃逸人体防御的双重策略

乙肝病毒(HBV)感染是全球主要公共卫生问题之一，有超过2.5亿人慢性感染HBV。而其中有超三分之一的人口集中在我国，人数接近1亿人。NTCP工具细胞，特别是外源表达NTCP的肝癌细胞系如HepG2-NTCP和Huh7-NTCP，因其易操作、短周期、重现性佳的特点，在乙肝病毒(HBV)研究中扮演着至关重要的角色。这些细胞模型能够有效模拟HBV的感染过程，为研究HBV的生命周期、宿主限制因子、病毒复制以及药物筛选提供了一个强大而便捷的体外平台。它们不仅有助于揭示HBV感染的分子机制，如DDX3作为宿主限制因子阻碍cccDNA转录，GPC5作为附着因子在感染入胞过程中的作用，还能通过直接与NTCP相互作用或下调NTCP表达来筛选和验证抗病毒药物的活性，例如环孢菌素A及其衍生物、雷帕霉素及其衍生物等。此外，这些工具细胞还促进了对HBV宿主特异性分子的发现，为发展支持HBV感染的小动物模型提供了可能，这对于乙肝相关研究和药物开发具有重大意义。

基本信息

英文标题：Joint host-pathogen genomic analysis identifies hepatitis B virus mutations associated with human NTCP and HLA class I variation

中文标题：宿主 - 病原体联合基因组分析鉴定与人类 NTCP 和 HLA I 类变异相关的乙型肝炎病毒突变

发表期刊：《American Journal of Human Genetics》

影响因子：8.1

作者单位：

1. School of Life Sciences, École Polytechnique Fédérale de Lausanne, Lausanne, Switzerland

2. Swiss Institute of Bioinformatics, Lausanne, Switzerland

3. Department of Infectious Diseases, Molecular Virology, University Hospital Heidelberg, Heidelberg, Germany

作者信息：

Zhi Ming Xu, Gnimah Eva Gnouamozi, Sina Rüeger

研究背景

乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球重大公共卫生问题，慢性感染可导致肝硬化和肝癌。宿主遗传变异与 HBV 感染的易感性及疾病进展密切相关，例如东亚人群中常见的 NTCP 基因变异(rs2296651，S267F)与 HBV 感染抵抗相关，而 HLA I 类基因变异影响病毒抗原呈递。本研究通过整合 567 例慢性 HBV 感染者的宿主外显子和病毒超深度基因组测序数据，采用 “基因组 - 基因组”(G2G)关联分析，系统筛选受宿主遗传压力驱动的 HBV 突变，揭示病毒逃逸机制对宿主受体和免疫选择的适应。

研究方法

研究人员收集了来自四项 III 期临床试验的 567 例慢性乙型肝炎患者的配对血液和治疗前 HBV DNA 样本，通过 Beckman Biomek FXp 系统提取宿主基因组 DNA，利用 Roche 或 IDT 外显子捕获试剂盒结合 Illumina 测序进行外显子测序，病毒基因组则通过 DDL Diagnostics 实验室的改良方案扩增后进行 Illumina MiSeq 测序，平均覆盖度约 6,800×。通过 PLINK 和 GATK 进行变异检测和质量控制，利用 GCTA 进行主成分分析以确定遗传 ancestry，并使用 HLA-LA 和 PyHLA 软件进行 HLA 等位基因和氨基酸变异的推断。在 G2G 关联分析中，采用 SAIGE 软件的广义线性混合模型，校正年龄、性别、人类前四个主成分和病毒前六个系统发育主成分，筛选常见人类 SNPs(MAF>0.05)与 HBV 氨基酸突变( minor allele count>20)的关联。此外，通过 AlphaFold-Multimer 构建 preS1-NTCP 结合模型，合成 Myristoylated 肽段进行体外结合实验，并利用 NetMHCpan 和 MixMHCpred 预测 HBV 突变对 HLA 结合的影响。

实验结果

图1：基因组 - 基因组关联分析识别宿主 - 病毒互作热点

图 1 展示了宿主染色体与 HBV 蛋白的关联位点：14 号染色体 SLC10A1 基因区(NTCP)和 6 号染色体 HLA-A 区与 HBV preS1 及 precore/core 区突变显著关联。实线表示经 Bonferroni 校正的显著性关联(p<9.6×10⁻¹¹)，虚线为全基因组显著水平(p<5×10⁻⁸)。结果显示东亚队列中 NTCP S267F 与 preS1 突变的强相关性，欧洲队列中 HLA-A 变异与 precore/core 突变的关联。

图2：HLA-A 变异与 HBV 免疫逃逸突变的关联

图 2 通过条件分析验证 HLA-A 区域关联的特异性：A. 东亚队列中 HLA-A T99I 和 HLA-A33:03 与 precore/core 区 160 位突变(A)关联;B. HLA-A02:06 与聚合酶区 49 位突变(N)关联;C. 欧洲队列中 HLA-A K170Q 和 HLA-A*01:01 与 precore/core 区 67 位突变(Y)关联。突变均位于 HLA 限制的 T 细胞表位内，且降低预测的 HLA 结合亲和力。

图3：preS1 受体结合区的宿主选择压力分析

图 3 显示 NTCP S267F 携带者中 preS1 变异多样性增加：A-B. 基因型 C 感染者中，rs2296651 杂合子(G/A)的 preS1 位点 17、35、51 变异频率高于野生型(G/G);C-D. 基因型 B 感染者中类似趋势;E-F. 单倍型分析显示逃逸单倍型(如 ARP)在 NTCP 变异携带者中富集，提示病毒通过组合突变适应宿主受体变异。

图4：preS1-NTCP 结合的体外功能验证

图 4 通过合成肽段结合实验证实逃逸突变的功能：A. 构建稳定表达 NTCP WT 和 S267F 的 HepG2 细胞系;B. 合成携带 preS1 突变的 Myristoylated 肽段(Myr-ARP);C-D. 流式细胞术显示 Myr-ARP 与 NTCP S267F 的结合亲和力较野生型肽段(Myr-WT)部分恢复，但未完全逆转 NTCP 变异的抑制作用。

图5：HBV 突变对 HLA 结合亲和力的影响

图 5 显示 HLA 关联的 HBV 突变削弱抗原呈递：A. HLA-A01:01 携带者中，precore/core 区 67 位 Y→F 突变降低肽段结合亲和力;B. HLA-A02:06 相关的聚合酶区 49 位突变(V→N)减少强结合肽段;C. HLA-A*33:03 相关的 precore/core 区 160 位突变(W→A)降低 HLA 结合效率。突变肽段在对应 HLA 携带者中频率更高，印证免疫逃逸假说。

研究结论

研究发现 HBV preS1 区的 17、35、51 位氨基酸突变(S17A、G35R、H51P)与东亚人群特有的 NTCP 变异(rs2296651，S267F)显著关联，体外结合实验表明这些突变可部分增加 preS1 与 NTCP S267F 的结合亲和力，且在 NTCP 变异携带者中 preS1 区域呈现更高的非同义核苷酸多样性，提示病毒通过适应性突变逃逸 NTCP 介导的 entry 抑制。此外，HBV precore/core 和聚合酶区的突变与 HLA-A 等位基因(如 HLA-A01:01、HLA-A02:06)相关，这些突变导致 HLA 结合亲和力降低，且富集于对应 HLA 携带者中，证实 HBV 通过削弱抗原呈递逃避免疫识别。该研究首次通过 G2G 分析揭示 HBV 对宿主受体和 HLA 限制的双重逃逸策略，为开发针对变异病毒的治疗策略提供了理论依据。